短小芽孢杆菌基因无痕修饰系统的建立及应用

短小芽孢杆菌基因无痕修饰系统的建立及应用

论文摘要

为了实现对短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SCU11基因组连续地无痕改造,提高碱性蛋白酶产量,本文建立了基于Upp基因反向筛选的短小芽孢杆菌基因无痕修饰系统,将碱性蛋白酶基因AprE的1份拷贝无痕插入至短小芽孢杆菌染色体16S rDNA区.摇瓶发酵实验显示,突变菌株碱性蛋白酶活最高达到7125 U/mL,与出发菌株相比提高了33.1%.结果表明利用该系统可实现对短小芽孢杆菌基因组的无痕修饰,对AprE插入突变菌株进行双交换筛选的最终效率约为23.07%.

论文目录

  • 1 引 言
  • 2 材料与方法
  •   2.1 材 料
  •     2.1.1 菌种和质粒
  •     2.1.2 培养基与试剂
  •     2.1.3 主要试剂
  •   2.2 方 法
  •     2.2.1 基因组及质粒提取、E.coli的转化
  •     2.2.2 引物设计
  •     2.2.3 短小芽孢杆菌电转化
  •     2.2.4 Upp基因敲除打靶载体的构建
  •     2.2.5 Upp基因回补载体的构建
  •     2.2.6 靶向插入载体pUCETs-AprE的构建
  •     2.2.7 Upp无痕缺失菌株的筛选及鉴定
  •     2.2.8 AprE无痕插入突变菌株的筛选及鉴定
  •     2.2.9 生长曲线的测定
  •     2.2.10 短小芽孢杆菌蛋白酶发酵及酶活力测定
  • 3 结 果
  •   3.1 短小芽孢杆菌Upp基因的敲除
  •     3.1.1 B. pumilus SCU11对5-FU敏感性实验
  •     3.1.2 Upp基因敲除打靶载体的构建
  •     3.1.3 Upp基因的无痕敲除及筛选
  •   3.2 Upp基因作为反向筛选标记基因的有效性分析
  •   3.3 短小芽孢杆菌基因无痕修饰体系的应用
  •     3.3.1 靶向插入载体pUCETs-AprE的构建
  •     3.3.2 短小芽孢杆菌AprE插入菌株的筛选鉴定
  •     3.3.3 野生型与突变体菌株生长曲线的测定
  •     3.3.4 野生型与突变株摇瓶发酵及酶活力测定
  • 4 讨 论
  • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 张长斌,徐云帆,李茜,覃佳,王海燕

    关键词: 短小芽孢杆菌,无痕修饰,反向筛选,碱性蛋白酶

    来源: 四川大学学报(自然科学版) 2019年03期

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室

    基金: 国家高技术研究发展计划(2012AA022204)

    分类号: Q78

    页码: 544-552

    总页数: 9

    文件大小: 3513K

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