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猪传染性胃肠炎病毒膜蛋白亲和肽的原核表达及其病毒亲和性分析

2020-12-06阅读(99)

猪传染性胃肠炎病毒膜蛋白亲和肽的原核表达及其病毒亲和性分析

论文摘要

为了研究猪传染性胃肠炎病毒膜蛋白（M蛋白）亲和肽的病毒亲和性,建立快速有效的TGEV检测方法,设计了1条含有TGEV M蛋白亲和肽的串联基因,核苷酸序列依据大肠杆菌偏爱密码子进行优化,人工基因合成获得了含有M蛋白亲和肽基因的重组质粒pUC57-MQHT。然后,根据合成基因的序列,设计合成了1条特异性引物,以pUC57-MQHT为模板,通过PCR获得了150 bp的TGEV M蛋白亲和肽基因。亲和肽基因通过BamHⅠ/XhoⅠ多克隆位点分别插入至原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1,获得重组质粒pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT。重组质粒经BamHⅠ单酶切和BamHⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）,经IPTG诱导,获得了重组蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT,分子质量分别为25,31 ku。切胶纯化后,重组蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT分别经His标签单克隆抗体和GST标签单克隆抗体鉴定,鉴定结果表明,获得的纯化蛋白为目的蛋白。Western Blot分析表明,2种重组蛋白可与TGEV特异性结合。Dot-ELISA分析表明,在TGEV滴度为1×103,5×102,2.5×102TCID50/mL时2种重组蛋白都可显示出阳性反应,而在1.25×102 TCID50/mL滴度时无可见斑点,具有良好的TGEV亲和性。阻断试验表明,1∶100或1∶200稀释的TGEV阳性血清可完全阻断TGEV H株（1×105TCID50/mL）与2种重组蛋白的结合,特异性良好。为建立TGEV诊断方法奠定了一定的理论和物质基础。

论文目录

  • 1 材料和方法
  •   1.1 试验材料
  •     1.1.1 菌种、质粒和抗体
  •     1.1.2 主要试剂
  •   1.2 试验方法
  •     1.2.1 TGEV M蛋白亲和肽基因的设计与合成
  •     1.2.2 M蛋白亲和肽基因的亚克隆
  •     1.2.3 重组表达载体的构建
  •     1.2.4 重组蛋白的诱导表达
  •     1.2.5 重组蛋白的纯化及鉴定
  •     1.2.6 Western Blot鉴定重组蛋白的病毒亲和性
  •     1.2.7 Dot-ELISA鉴定重组蛋白病毒亲和性
  •     1.2.8 阻断试验
  • 2 结果与分析
  •   2.1 重组质粒pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT的酶切鉴定
  •   2.2 重组蛋白的表达
  •   2.3 重组蛋白的纯化及鉴定
  •   2.4 Western Blot鉴定重组蛋白的病毒亲和性
  •   2.5 Dot-ELISA鉴定重组蛋白病毒亲和性
  •   2.6 阻断试验
  • 3 结论与讨论

    • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 于天飞,董慧莹,谢鹏宇,孙婉姝,尹海畅,黎明,于志丹

    关键词: 传染性胃肠炎病毒,膜蛋白,亲和肽,原核表达,亲和性

    来源: 华北农学报 2019年05期

    年度: 2019

    分类: 农业科技,基础科学

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,齐齐哈尔大学计算机与控制工程学院

    基金: 黑龙江省自然科学基金项目(QC2014C034),黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划(UNPYSCT-2015093),黑龙江省省属高等学校基本科研业务费特色学科专项(YSTSXK201881),齐齐哈尔大学研究生创新科研项目(YJSCX2017-030X)

    分类号: S852.651

    页码: 224-230

    总页数: 7

    文件大小: 2258K

    下载量: 102

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