基于极大倾角石墨烯光纤光栅生物传感器的禽流感快速检测方法研究

论文摘要

禽流感（avian influenza,AI）由正粘病毒科A型流感病毒引起的全身性传染病,国际兽疫局（OIE）将其定为A类传染病,不仅严重危害养禽业,而且给公共卫生造成巨大威胁,因此国家将防治禽流感作为重要任务。目前,对禽流感的主要检测技术有血凝-血凝抑制（HA-HI）试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）和胶体金等方法。前者比较敏感,但受外界因素影响较大而削弱了其实用价值;ELISA适合于大批量血清学调查,但因其条件要求高,现场操作不便;PCR虽然可直接检出病毒的基因,但所需的设备昂贵,在临床检测方面受到了很大的限制;胶体金方法目前国内、外均有相关的产品问世,但其检测灵敏度不高,只能定性,不能定量,该方法只能用于疫病诊断的辅助检测。因此探索高效、特异、准确的检测手段对于禽流感的防控具有十分重要的意义。现有的禽流感血清学检测技术主要利用抗原抗体的反应,而目前国内禽流感病毒抗体产品质量参差不齐,国外已有比较成熟的商品化抗体,抗体试剂主要依赖于进口,但价格较昂贵。制备高效价、低成本、特异性强的单克隆抗体可为禽流感的防控提供必备的试剂原料。极大角度光纤光栅（excessively tilted fiber grating,Ex-TFG）免疫传感器具有检测灵敏度高、特异性好、免标记、设备便携、成本低的优点,具备临床检测潜力。前期本实验室已成功将Ex-TFG免疫传感器应用于猪圆环病毒2型（PCV2）、新城疫病毒（NDV）、心力衰竭生物标记物N末端前钠尿肽（NT-proBNP）、降钙素原（PCT）以及程序性死亡配体-1（PD-L1）的检测,将抗原抗体反应的特异性与光纤光栅传感器检测的敏感性结合,在检测的灵敏度上取得了突破,并发表了高水平研究论文。本文采用原核表达系统制备禽流感病毒HA抗原,利用聚乙二醇（PEG）细胞融合技术制备单克隆抗体,为禽流感的防控提供有效试剂;此外通过对极大角度光纤羟基化修饰后,涂覆氧化石墨烯（GO）分散液,使GO均匀固定在光纤表面形成涂覆层,利用1-（3-二甲基氨丙基）-3-乙基碳酰亚胺（EDC）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）使涂层羧基（-COOH）活化,结合单克隆抗体后将配制好的封闭液封闭未被结合的位点,检测不同滴度禽流感病毒标准液等实验样本,对传感器的重复性,特异性,临床样本检测等进行验证,初步建立一种基于Ex-TFG的禽流感病毒免疫传感器。该传感器具有特异性强,检测成本低,时间短等优点,为禽流感病毒的临床检测提供新的检测方法。本文的研究内容如下:1、为了实现禽流感病毒H5N1血凝素（HA）蛋白在原核表达系统中高效表达,根据GenBank公布的H5N1-HA（ID=DQ023145.1）基因序列,在不改变HA蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性利用DNAWorks2.4软件进行密码子优化,化学方法合成HA全基因,在HA基因的5’段和3’段分别设计酶切位点BamHI和EcoRI。将合成的HA基因进行BamHI和EcoRI双酶切,酶切产物回收后,插入到同样经过BamHI和EcoRI双酶切回收的pET28a（+）载体中,使用DNA Ligation Kit将HA基因克隆于pET28a（+）载体中,构建重组质粒pET28a（+）/HA。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受细胞中,优化各项因素（温度、诱导剂浓度、时间）,并筛选出最佳诱导条件,进行大量表达。利用His-tag镍柱纯化HA重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE纯度分析、二喹啉甲酸（BCA）法浓度测定及Western-blot特异性鉴定。2.将上述制备的H5N1-HA蛋白作为免疫原,采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠,取4次免疫后的小鼠脾脏制成脾细胞悬液,然后与骨髓瘤细胞混合,以PEG1500作为融合剂进行细胞融合;对融合细胞以及多次亚克隆后细胞上清中的抗体采用间接ELISA法进行筛选,将筛选到的阳性孔进行至少2次以上的亚克隆,最终获得可稳定分泌抗体的单克隆阳性杂交瘤细胞,扩大培养细胞并制备单抗腹水,对抗体进行亚型鉴定,并根据抗体亚型,选择相应的纯化方法进行纯化,对纯化后的抗体进行生物特性鉴定。3.对极大角度光纤光栅（Ex-TFG）表面进行外膜保护层刮出后,用5%的稀HNO3进行光纤洁净化处理;利用8mg/mL的NaOH溶液进行表面羟基化修饰后,使光纤表面带有羟基（-OH）,均匀涂覆GO分散液,做干燥固定处理后电子显微镜观察涂敷情况,石墨烯良好的水溶性极有利于包裹在光纤周围,形成致密膜层。涂敷良好后固定禽流感单克隆抗体并封闭表面多余位点处理,再进行禽流感病毒的检测,并对此生物免疫传感器的重复性、特异性以及临床应用进行评定。结果:1.重组菌株pET28a（+）-HA/BL21（DE3）在诱导条件为30℃、IPTG浓度为1mmol/L诱导10h时,HA蛋白表达量最高;SDS-PAGE电泳显示菌体裂解之后上清表达量明显高于沉淀,表明为可溶性表达,经镍柱亲和层析纯化所得HA蛋白纯度较高,达到了90%以上,Western blot显示在70KD处有明显的蛋白印迹条带,与预期相符,表明成功实现了HA蛋白在大肠杆菌高效表达。2.制备HA单克隆抗体,进行了一次细胞融合,铺96孔板共4块板,其中克隆生长数为380孔,融合率为98.95%。阳性孔数为323孔,阳性率分别为84.1%;经过3次亚克隆并筛选,获得了4株具有抗禽流感HA的单克隆抗体细胞株,命名为1H8-F12,4G1-G11,4G1-E12,4G1-B11;经过亚型鉴定后1H8-F12,4G1-G11为IgG2b型抗体,4G1-E12为IgG2a型抗体,4G1-B11为IgG1型抗体;4株杂交瘤细胞株经反复冻存、复苏及多次传代,均能分泌高效价抗体;经Western-blot鉴定后证实所获得单抗是特异性针对禽流感病毒HA抗原;将1H8-F12,4G1-G11细胞腹腔注射BALB/c小鼠,并收集了腹水,利用ProteinA柱进行纯化,SDS-PAGE电泳显示纯化后抗体纯度达到了90%以上,选取同一批次纯化所得峰值最高的收集液,使用BCA法测得其浓度最高值可达到2.6637 mg/mL。3.开展了对极大角度光纤羟基化修饰,GO涂覆,涂层活化,抗体固定,封闭,病毒检测,重复性,特异性,临床样本检测等各项实验研究,并进行了测试分析,结果显示:进过表面羟基化修饰后、涂敷氧化石墨烯、涂层活化、结合禽流感抗体的谐振波长偏移量分别为:0.027nm、0.065nm、0.022nm以及0.096nm,表明各步修饰成功进行。该免疫传感器对AIV的最低检测极限值（LOD）为0.1ng/mL（1.43pM）,检测的线性范围为0.1-5000ng/mL,达到了临床检测水平;重复性实验结果基本一致,表明传感器的重复性良好;对NDV尿囊液、AIV尿囊液两种不同的禽类病毒原液和AIV空白尿囊液进行了测试分析,结果表明该传感器对AIV具有高度的特异性,可满足临床检测要求。结论:本研究构建了禽流感病毒HA基因工程菌pET28a（+）-HA/BL21（DE3）,并筛选了最佳表达条件,成功实现了H5N1-HA蛋白在大肠杆菌中高效表达,制备并纯化了重组H5N1-HA蛋白;经过抗原免疫、细胞融合及克隆化筛选后得到4株能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株;利用制备的抗原、抗体,初步建立了基于GO涂敷的Ex-TFG的生物免疫传感器,并用于检测禽流感病毒。本研究制备的禽流感病毒重组HA抗原及单抗将为禽流感的防控提供有效试剂,研制的传感器具有检测灵敏度高,可重复性好、特异性强、可用于临床样品实时定量检测,为禽流感的防控提供了新的检测技术和方法。

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摘要

ABSTRACT

英文缩写索引

第1章绪论

1.1 禽流感病毒简介

1.1.1 AIV的病原学

1.1.2 AIV基因组及其编码的蛋白

1.2 禽流感的检测技术

1.2.1 病毒分离鉴定

1.2.2 血清学鉴定

1.2.3 分子生物学鉴定

1.2.4 基因芯片和蛋白质芯片检测技术

1.2.5 电化学传感器检测技术

1.3 倾斜光纤光栅传感器

1.3.1 倾斜光纤光栅的分类

1.3.1.1 小角度倾斜光纤光栅

1.3.1.2 45°倾斜光纤光栅

80°）倾斜光纤光栅'> 1.3.1.3 极大角度（>80°）倾斜光纤光栅

1.4 石墨烯光纤传感器

第2章禽流感HA基因的原核表达及鉴定

2.1 材料

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 主要设备

2.1.3 主要试剂

2.1.4 试剂配制

2.2 实验方法

2.2.1 pET28a（+）/HA重组质粒的鉴定

2.2.1.1 禽流感HA重组质粒的提取

2.2.1.2 重组质粒的双酶切鉴定

2.2.1.3 转化及再鉴定与保菌

2.2.2 HA重组蛋白表达方式的确定

2.2.3 选取HA重组蛋白最佳诱导条件

2.2.3.1 选取HA重组蛋白最佳诱导表达温度

2.2.3.2 选取HA重组蛋白最佳诱导表达IPTG浓度

2.2.3.3 选取HA重组蛋白最佳诱导时间

2.2.4 HA重组菌株的扩大培养

2.2.5 HA重组蛋白的纯化

2.2.5.1 菌体处理

2.2.5.2 HA重组蛋白的纯化

2.2.5.3 SDS-PAGE鉴定纯化产物

2.2.6 蛋白浓度测定

2.2.7 Western-Blot鉴定

2.3 结果

2.3.1 双酶切鉴定

2.3.2 重组质粒的可溶性表达验证

2.3.3 筛选重组菌株最佳诱导条件

2.3.4 HA重组蛋白纯化

2.3.5 重组蛋白浓度测定

2.3.6 Western-Blot鉴定

2.4 讨论

第3章抗禽流感病毒单克隆抗体的制备

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物及细胞

3.1.2 主要仪器

3.1.3 主要试剂

3.1.4 试剂配制

3.2 实验方法

3.2.1 小鼠腹腔免疫

3.2.2 融合前最佳抗原包被浓度及血清效价的测定

3.2.3 制备饲养细胞

3.2.4 制备小鼠骨髓瘤细胞SP2/

3.2.5 制备小鼠脾细胞

3.2.6 细胞融合

3.2.7 阳性杂交瘤细胞的筛选

3.2.8 阳性杂交瘤细胞的克隆化

3.2.9 制备大量小鼠抗体腹水

3.2.10 单抗型腹水的纯化（规格：1m LProtein A柱）

3.2.11 单克隆抗体的鉴定

3.2.11.1 单抗纯度鉴定

3.2.11.2 单抗浓度测定

3.2.11.3 禽流感HA单克隆抗体亚类鉴定

3.2.11.4 单克隆抗体效价测定

3.2.11.5 Western-Blot鉴定单克隆抗体的特异性

3.3 结果

3.3.1 抗原最佳包被浓度的确定

3.3.2 融合前小鼠效价的测定

3.3.3 细胞融合结果

3.3.4 多克隆细胞的筛选及克隆化

3.3.5 单抗的纯化

3.3.6 单抗纯度鉴定

3.3.7 单克隆抗体浓度的测定

3.3.8 单克隆抗体亚型鉴定

3.3.9 效价测定

3.3.10 Western-Blot检测

3.4 讨论

第4章禽流感生物传感器检测的初步研究

4.1 实验材料

4.1.1 AIV病毒与抗体

4.1.2 主要仪器设备

4.1.3 主要试剂

4.1.4 溶液配制

4.2 方法

4.2.1 检测平台的搭建

4.2.2 Ex-TFG表面预处理

4.2.3 Ex-TFG表面羟基化

4.2.4 Ex-TFG表面GO修饰

4.2.5 Ex-TFG光纤生物功能化

4.2.6 Ex-TFG免疫传感器对禽流感病毒的检测

4.3 实验结果

4.3.1 Ex-TFG光栅的表面修饰谐振频谱变化

4.3.2 Ex-TFG表面GO修饰

4.3.3 抗体的固定

4.3.4 禽流感病毒检测

4.4 分析与讨论

第5章总结与展望

5.1 全文总结

5.2 展望

致谢

参考文献

个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李令臣

导师: 吴胜昔

关键词: 禽流感病毒,原核表达,单克隆抗体,石墨烯修饰

来源: 重庆理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技,信息科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学,自动化技术

单位: 重庆理工大学

分类号: S852.65;TP212.3

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