李宗明1李秀凤2
(1漯河医学高等专科学校神经生物学实验室河南漯河462002)
(2漯河医学高等专科学校第一附属医院妇产科河南漯河462000)
【摘要】为了研究识别不同类型脊髓神经元参与躯体运动的调节作用，我们采用表达绿色荧光蛋白转基因鼠的脊髓片，进行形态观察和全细胞膜片钳记录。结果表明荧光标记神经元为中小型中间神经元，其胞体位于脊髓中央灰质第VII层、VIII层和中央管细胞群(X层)，其细胞的静息膜电位为-63.5±1.5mV，这些神经元没有自发放电，但当一个去极化电流脉冲注入细胞可引起神经元的兴奋，发放动作电位，并随着刺激强度的增加，发放动作电位的频率也增加，部分神经元表现出L型钙通道电流，这有助于理解脊髓中间神经元对躯体运动的调节作用。
【关键词】绿色荧光蛋白脊髓中间神经元运动调节
【中图分类号】R744【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2014）09-0043-01
为了清楚脊髓神经元在躯体运动发生中的作用，首先就必须了解参与躯体运动的脊髓神经元的电生理特性，这些特性在脊髓神经元的兴奋传递及相互调制过程中发挥着重要作用。但是最困难的问题就是如何识别所涉及的脊髓神经元。用表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的转基因小鼠作为在中枢神经系统中识别不同类型神经元的技术方法，是一项新的研究热点[1]。本研究就是采用表达增强型绿色荧光蛋白转基因小鼠的脊髓片，通过形态观察和记录神经元的电活动情况来识别参与脊髓兴奋调制作用的脊髓神经元类型。
1.材料和方法
1.1转基因小鼠：将含有表达增强型绿色荧光蛋白质粒进行纯化，用EcoRI和AflII切割释放出DNA片段，利用受精卵原核显微注射的方法，导入B6C3F1受精小鼠胚胎原核，然后植入假孕雌性鼠进行繁殖。
1.2膜片钳记录：转基因小鼠（8-15天龄）被用氯胺酮（100mg／kg）腹腔注射麻醉。脊髓分离手术在小于4℃的人工脑脊液（ACSF）中进行。人工脑脊液内含有氯化钠25mM，蔗糖188mM，氯化钾1.9mM，磷酸二氢钠1.2mM，硫酸镁10mM，碳酸氢钠261.5mM，葡萄糖25mM。分离出的下胸腰段脊髓被用振动切片机（VT1000S，德国）切成300μM厚的脊髓片，立即放进36℃温暖的ACSF中，并连续给予95%氧+5%的CO2。暖的人工脑脊液含氯化钠119mM，氯化钾1.9mM，磷酸二氢钠1.2mM，硫酸镁10mM，氯化钙1mM，碳酸氢钠26mM，葡萄糖10mM，3%葡聚糖，pH值7.4。脊髓片被放在红外微分干涉对比显微镜下观察和进行电生理记录，EGFP-荧光标记神经元被识别。对EGFP神经元全细胞膜片钳的记录在室温（20-22℃）下进行，实验数据被Axopatch-700B放大器和Digidata1440A数据采集系统（Axon仪器）采集，用pCLAMP10.0软件进行分析。全细胞记录是在电流钳模式进行，桥式平衡和电容补偿被应用。记录电极（世界精密仪器公司），用1.5mm直径薄壁玻璃微电极拉制（PC-10，Narishige科学仪器实验室，日本）,其电极阻抗约3-6m?。微电极管内溶液含有（mM）：K-葡糖酸钾135；HEPES10；氯化镁1；EGTA10；氯化钙1；氯化钠6；ATP3；GTP0.3；谷胱甘肽5；蔗糖20。FPL64176和上述化学物品购买自sigma公司。
1.3统计分析
实验结果表示为平均值±S.E.M。采用方差分析和Student’st检验进行统计数据比较。P值小于0.05被认为具有显著性差异。
2.结果
2.1部位和形态：EGFP-荧光标记神经元多位于脊髓灰质中部VII层、VIII层和靠近中央管（X层）附近，为多极神经元，直径约5-12μM.
2.2EGFP-荧光标记神经元的电生理特性：稳定的全细胞记录20个EGFP表达神经元，其细胞的静息膜电位为-63.5±1.5mV，膜电容为79.2±18.5pF,膜电阻是129.7±17.4mΩ，动作电位的幅度76.2±5.1，阈电位为-41.5±3.0mV。这些神经元没有自发放电，但当一个去极化电流脉冲（0.3-0.7nA）注入细胞可引起神经元的兴奋，发放动作电位，随着刺激强度的增加，发放动作电位的频率也增加，放电频率从0.3nA时2.0±1.5Hz增加到0.7nA时28.0±5.2Hz(n=20,p<0.01)。转基因小鼠的EGFP-荧光标记神经元中，六个神经元在灌流液中加入FPL64176（L-型钙通道激活剂）后的兴奋性增加，表现为放电频率从加入前的3.0±1.2Hz到加入后21.0±3.2(n=6，刺激0.3nA，p<0.01)。
讨论
近年来,关于脊髓神经元局部环路在躯体运动中的调制作用成为研究热点，其中重要的问题就是产生节奏性运动的发生区域在哪里，如何识别这一特定区域和清楚哪些脊髓神经元参与运动的调节，这就需要运用一些特殊的生物学技术方法来标记和研究特定的脊髓神经元,了解它们的电生理特性和对哺乳动物运动的影响[2][3]。我们的研究表明由表达增强型绿色荧光蛋白的转基因小鼠脊髓荧光标记神经元为中小型中间神经元，其胞体位于脊髓中央灰质第VII层、VIII层和靠近中央管细胞群(X层)，是局部回路神经元，在神经兴奋传导路径中起连接传递兴奋作用。它们接受感觉神经元传来的神经冲动，再将冲动传递到运动神经元，并对运动神经元的兴奋进行调制来协调肢体的运动。这些绿色荧光神经元表现出L型钙通道电流。一些神经递质如5-羟色胺，乙酰胆碱等通过上调Ca2+通道来兴奋神经元。这些神经元在运动的发生和活动协调方面发挥着作用。上述实验结果表明通过记录转基因动物表达EGFP荧光标记神经元的电生理特性来研究确定脊髓神经元的功能作用是一项新的重要研究技术。
参考文献
[1]OhmuraN,KawasakiK,SatohT,HataY.:Invivoelectroporationtophysiologicallyidentifieddeepbrainregionsinpostnatalmammals.BrainStructFunct.2014Feb14.
[2]CholanianM,Krajewski-HallSJ,LevineRB,McMullenNT,RanceNE.：ElectrophysiologyofArcuateNeurokininBNeuronsinFemaleTac2-EGFPTransgenicMice.Endocrinology.2014,1065.
[3]PunnakkalP,vonSchoultzC,HaenraetsK,WildnerH,ZeilhoferHU.：Morphological,biophysicalandsynapticpropertiesofglutamatergicneuronsofthemousespinaldorsalhorn.JPhysiol.2014;592(4):759-76.