抗猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及功能验证

论文摘要

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种以脱水、腹泻、肠绒毛严重萎缩为主要病变的传染病。2010年以来,PEDV变异株在世界多国猪场相继暴发流行,其对哺乳仔猪致病性强、死亡率高,一周龄以下的仔猪感染后其致死率可高达100%。该PEDV变异株的出现在我国及全球造成重大经济损失,严重威胁着养猪业的健康发展,开发用于检测PEDV感染的制剂和相应方法显得尤为重要且紧迫。核衣壳蛋白（N）在不同的PEDV毒株间高度保守、且在宿主感染早期合成,因此,PEDV N蛋白是作为感染早期检测的理想靶标。为有助于开发一系列检测PEDV感染的方法,本研究制备了抗PEDV N蛋白的单克隆抗体,并测试了其在不同检测方法中的应用前景。首先,本研究从PEDV LJX/2014毒株中采用RT-PCR方法扩增获得了N基因,随后将其因克隆至pET-30a（+）原核表达载体,获得了表达PEDV N蛋白的重组表达质粒,并将其命名为pET-N。将pET-N转化至BL-21（DE3）感受态细胞中表达N蛋白,结果表明,该目标蛋白以分泌型及包涵体形式同时表达。经优化表达条件,最终获得大量分泌型表达的N蛋白。采用镍柱亲和层析技术对所获得的重组N蛋白进行纯化,结果显示,本研究获得高纯度的PEDV N蛋白。将200μg纯化后的PEDV N蛋白与ISA15佐剂混合后于背部皮下多点免疫BALB/c小鼠,每两周以相同剂量及方式进行加强免疫。第三次免疫一周后,采用等量N蛋白于腹腔注射进行加强免疫,3 d后处死小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选获得杂交瘤细胞。杂交瘤细胞经过三轮亚克隆筛选后,共获得6株稳定分泌抗PEDV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经单克隆抗体分型试剂盒鉴定,该6株单克隆抗体（mAbs）的重链均为IgG1亚类,轻链为?链。制备6株mAbs的腹水,其抗体滴度均在稀释度128000倍以上。除采用ELISA检测纯化后的PEDV N蛋白与mAbs的反应性外,我们还采用IFA和流式细胞术检测PEDV LJX/2014毒株接种的Vero-E6细胞与6株mAbs的反应性,同时用Western blotting检测其细胞裂解物与mAbs的反应性,上述结果均显示,本课题制备的mAbs均能用于间接免疫荧光（IFA）、Western blotting以及流式细胞术的检测分析。采用截短表达的策略,对mAb进行表位鉴定,采用间接ELISA方法分析这6株mAbs的表位所在区段。结果表明,3F12单抗株识别线性表位VAAKDALKSLGI,推测其余单抗株分别识别N181-379区段内的不同构象表位。综上所述,本研究成功制备了6株针对PEDV N蛋白的mAbs;测定了6株mAbs的亚型及其亲和性;分析了它们在ELISA、IFA、Western blotting和流式细胞术等方法中的应用;制备了6株mAbs的腹水,鉴定了mAbs的抗原表位。

论文目录

摘要

abstract

第一章引言

1.1 冠状病毒

1.2 常见的猪冠状病毒

1.3 猪流行性腹泻（PEDV）及N蛋白

1.3.1 PEDV的发展及流行

1.3.2 PEDV的结构组成及功能

1.4 抗体

1.5 单克隆抗体

1.6 研究目的与意义

第二章 PEDV N蛋白的基因克隆、表达及纯化

2.1 材料

2.1.1 病毒株、菌株、细胞株和质粒

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 PEDV N蛋白的基因扩增

2.2.1.1 PEDV的 RNA提取

2.2.1.2 PEDV N蛋白基因的扩增

2.2.2 重组质粒pET-N的构建

2.2.2.1 限制性内切酶酶切实验

2.2.2.2 重组质粒的连接

2.2.2.3 连接产物的转化

2.2.2.4 重组质粒的提取

2.2.3 质粒pET-N阳性克隆的鉴定

2.2.3.1 质粒pET-N的双酶切鉴定

2.2.3.2 重组质粒的PCR鉴定

2.2.3.3 重组质粒的测序鉴定

2.2.4 PEDV N蛋白的表达、鉴定及纯化

2.2.4.1 PEDV N蛋白的表达

2.2.4.2 PEDV N蛋白的SDS-PAGE及 Western blotting分析鉴定

2.2.4.3 PEDV N蛋白的纯化

2.3 实验结果

2.3.1 PEDV N基因的克隆

2.3.2 PEDV N蛋白的表达

2.3.3 PEDV N蛋白的纯化

2.4 讨论

第三章抗PEDV N蛋白的mAbs的制备及验证

3.1 材料

3.1.1 病毒株、菌株、细胞株和质粒

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器设备

3.1.4 实验动物

3.2 实验方法

3.2.1 小鼠免疫

3.2.1.1 酶联免疫吸附实验（ELISA）

3.2.2 杂交瘤细胞的制备

3.2.3 筛选杂交瘤细胞筛选及鉴定

3.3 实验结果

3.3.1 抗PEDV N蛋白mAbs的制备

3.3.2 抗PEDV N蛋白mAbs的亚类鉴定

3.3.3 抗PEDV N蛋白mAbs的腹水效价测定

3.3.4 单克隆抗体5F3 的亲和性

3.4 讨论

第四章抗PEDV N蛋白的mAbs的功能验证

4.1 材料

4.1.1 病毒株、菌株、细胞株和质粒

4.1.2 主要试剂

4.1.3 主要仪器设备

4.2 实验方法

4.2.1 间接免疫荧光（IFA）

4.2.2 流式细胞术

4.3 实验结果

4.3.1 抗PEDV N蛋白mAbs的 ELISA反应性检测

4.3.2 抗PEDV N蛋白mAbs的 Western blotting反应性检测

4.3.3 抗PEDV N蛋白mAbs的 IFA反应性检测

4.3.4 抗PEDV N蛋白mAbs的流式细胞术反应性检测

4.3.5 单克隆抗体5F3 的亲和性检测

4.4 讨论

第五章抗PEDV N蛋白的mAbs的抗原表位鉴定

5.1 材料

5.1.1 病毒株、菌株、细胞株和质粒

5.1.2 主要试剂

5.1.3 主要仪器设备

5.2 实验方法

5.2.1 PEDV N蛋白截短肽的表达

5.2.2 PEDV N蛋白截短肽的合成

5.3 实验结果

5.3.1 PEDV N蛋白截短肽的表达

5.3.2 PEDV N蛋白截短肽的验证

5.3.3 mAb精细表位的鉴定

5.4 讨论

第六章全文结论

参考文献

致谢

作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨文婷

导师: 刘光亮

关键词: 猪流行性腹泻病毒,核衣壳蛋白,单克隆抗体

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: 国家自然基金面上项目(31572498)

分类号: S852.4

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抗猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及功能验证

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