酪醇的羟基化与糖基化研究

论文摘要

苯乙醇苷类化合物（PhGs）是一类含酚羟基、苯乙醇苷、糖基组成的糖苷类化合物。常见的苯乙醇苷类化合物有酪醇、羟基酪醇、红景天苷、毛蕊花糖苷、松果菊苷等。药理研究表明,该类化合物具有保护心血管系统、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、肝保护、增强记忆等功效。近年来,因其广泛的药理作用,成为生物研究和医学领域的研究热点,且需求量正逐年增加。本实验通过构建petDuet-1-hpaB-C/BL21（DE3）与petDuet-1-ugt73b6/BL21（DE3）工程菌,在培养过程中,添加前体酪醇,对其羟基化与糖基化,进行苯乙醇苷类化合物的生物转化。实验研究内容与结果如下:（1）PCR扩增hpaB基因,构建hpaB-T克隆质粒。hpaC基因由公司合成,自主构建重组质粒petDuet-1-hpaC。提取测序结果正确的hpaB-T与petDuet-1-hpaC质粒分别进行双酶切、纯化回收、连接、转化等步骤,构建原核表达工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21（DE3）,通过诱导表达,实验结果,工程菌分别在57.2 KD与18.7 KD处有特异性蛋白条带,与目标蛋白分子量相符。（2）糖基转移酶基因ugt73b6由生工生物工程（上海）股份有限公司合成,构建工程菌petDuet-1-ugt73b6/BL21（DE3）,培养工程菌并诱导表达,将表达产物进行SDS-PAGE分析。实验结果表明,在16℃诱导24 h,样品经SDS-PAGE分析,在52.8 KD左右产生特异性蛋白条带,与目的蛋白分子量大小相符。（3）培养工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21（DE3）,通过添加外源前体酪醇,进行生物转化。样品通过HPLC与质谱法的鉴定,实验结果表明有目标产物羟基酪醇。（4）培养工程菌petDuet-1-ugt73b6/BL21（DE3）,通过添加前体酪醇,实现酪醇到红景天苷的生物转化。（5）共同培养工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21（DE3）与工程菌petDuet-1-ugt73b6/BL21（DE3）,添加前体酪醇,同时进行羟基化和糖基化,实验实现了酪醇到3,4-二羟基苯乙醇葡萄糖苷及其同分异构体的生物转化,为进一步糖基化合成毛蕊花糖苷与松果菊苷奠定实验基础。（6）为比较两工程菌对羟基酪醇的转化率,设计相关实验,工程菌hpaB-Pet-28a/BL21（DE3）在诱导温度16℃条件下,转化时间在5 h时,羟基酪醇的生物转化率最高值为70%。工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21（DE3）在相同的条件下诱导,转化时间在1/2 h时,羟基酪醇的生物转化率最高值为92%。实验表明,在相同实验条件下,工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21（DE3）有利于羟基酪醇的生物转化。（7）为优化工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21（DE3）对羟基酪醇生物转化条件,在生物转化时间和诱导温度条件上进行优化。在生物转化时间上发现,随着转化时间的延长,羟基酪醇转化率会增加,但并不是成正比关系,在一定时间范围内有所增加,当增加到最大值便呈现下降趋势。实验表明,工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21（DE3）转化时间在1/2 h时,诱导条件为16℃,转化体系中羟基酪醇的转化率最高值为92%。（8）为提高红景天苷的生物转化效率,构建真核表达体系。构建重组质粒pPIC9K-ugt73b6,重组质粒线性化后,通过电击的方式转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中,在4个浓度渐增的遗传霉素（0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL）YPD平板筛选高转化子。挑取高浓度遗传霉素平板上单菌落培养后提取基因组,以基因组为模板进行PCR鉴定,将经鉴定结果正确的重组型酵母工程菌命名为pPIC9K-ugt73b6/GS115。对工程菌进行发酵培养和诱导,样品经SDS-PAGE分析,结果表明,诱导时间为48 h、72 h时有特异蛋白条带,蛋白条带分子量约52.8 KD,与目标产物相符。

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摘要

Abstract

英文缩写对照表

第一章绪论

1.研究意义与背景

2.苯乙醇苷类化合物介绍

2.1 羟基酪醇

2.1.1 羟基酪醇的获取途径

2.1.2 羟基酪醇的药理作用

2.2 红景天苷

2.2.1 红景天苷的获取途径

2.2.2 红景天苷的药理作用

2.3 其他苯乙醇苷类化合物

第二章羟基化酶与糖基转移酶的基因克隆与原核表达

1.引言

2.材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验仪器

2.1.2 实验试剂

2.1.3 主要试剂配制

2.1.4 引物

2.2 方法

2.2.1 大肠杆菌BL21（DE3）基因组DNA的提取与检测

2.2.2 PCR扩增hpa B基因序列

2.2.3 PCR产物纯化

2.2.4 hpa B基因片段加poly（A）后纯化

2.2.5 连接及转化

2法）'> 2.2.5.1 E.coli DH5ɑ感受态细胞的制备（CaCl₂法）

2.2.5.2 连接及转化

2.2.5.3 阳性转化子的鉴定

2.2.6 工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21（DE3）的构建

2.2.6.1 hpa B-T、petDuet-1-hpaC质粒提取

2 法）'> 2.2.6.2 E.coli BL21（DE3）感受态细胞的制备（CaCl₂法）

2.2.6.3 hpa B 基因与 pet Duet-1-hpa C 质粒相连接

2.2.6.4 转化

2.2.7 重组质粒petDuet-1-hpaB-C的鉴定

2.2.7.1 重组质粒petDuet-1-hpaB-C的提取

2.2.7.2 重组质粒的酶切鉴定

2.2.7.3 重组质粒petDuet-1-hpaB-C的PCR鉴定

2.2.7.4 基因序列测定

2.2.8 工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21（DE3）的表达

2.2.9 表达产物SDS-PAGE分析

2.2.10 工程菌petDuet-1-ugt73b6/BL21（DE3）的构建

2.2.10.1 质粒petDuet-1-ugt73b6的提取

2法）'> 2.2.10.2 E.coli BL21（DE3）感受态细胞的制备（CaCl₂法）

2.2.10.3 转化

2.2.10.4 工程菌petDuet-1-ugt73b6/BL21（DE3）的鉴定

2.2.11 工程菌petDuet-1-ugt73b6/BL21（DE3）的蛋白表达

2.2.12 表达产物SDS-PAGE分析

3.结果

3.1 hpa B基因序列扩增结果

3.2 重组质粒petDuet-1-hpaB-C的鉴定结果

3.3 重组质粒petDuet-1-hpaB-C测序结果

3.4 工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21（DE3）诱导表达结果

3.5 工程菌petDuet-1-ugt73b6/BL21（DE3）鉴定结果

3.6 工程菌petDuet-1-ugt73b6/BL21（DE3）诱导表达结果

4.讨论

第三章利用工程菌生物转化前体酪醇

1.引言

2.材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验仪器

2.1.2 菌株与试剂

2.1.3 主要试剂配制

2.2 方法

2.2.1 酪醇羟基化

2.2.1.1 对照品溶液的制备

2.2.1.2 色谱条件

2.2.1.3 质谱条件

2.2.1.4 工程菌对羟基酪醇的生物转化

2.2.2 羟基酪醇生物转化条件优化

2.2.2.1 生物转化时间对羟基酪醇转化率的影响研究

2.2.2.2 诱导温度对羟基酪醇转化率的影响研究

2.2.2.3 不同菌株对酪醇转化率的比较

2.2.3 酪醇糖基化

2.2.3.1 对照品溶液的制备

2.2.3.2 色谱条件

2.2.3.3 质谱条件

2.2.3.4 工程菌对红景天苷的生物转化

2.2.4 酪醇同时羟基化与糖基化

2.2.4.1 对照品溶液的制备

2.2.4.2 色谱条件

2.2.4.3 质谱条件

2.2.4.4 工程菌对 3,4-二羟基苯乙醇葡萄糖苷及其同分异构体的生物转化

3.结果

3.1 产物羟基酪醇的鉴定

3.2 产物红景天苷的鉴定

3.3 产物 3,4-二羟基苯乙醇葡萄糖苷及其同分异构体的鉴定

3.4 转化时间对羟基酪醇转化率的影响研究

3.5 诱导温度对羟基酪醇转化率的影响研究

3.6 两个工程菌对羟基酪醇转化率的比较

4.讨论

第四章糖基转移酶的真核表达

1.引言

2.材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验仪器

2.1.2 菌株、质粒与试剂

2.1.3 主要试剂配制

2.1.4 引物

2.2 方法

2.2.1 petDuet-1-ugt73b6质粒提取

2.2.2 ugt73b6基因序列扩增

2.2.3 ugt73b6基因片段加poly（A）后纯化

2.2.4 连接及转化

2.2.4.1 DH5ɑ感受态细胞的制备

2.2.4.2 连接及转化

2.2.5 阳性转化子的鉴定

2.2.6 重组质粒pPIC9k-ugt73b6的构建与鉴定

2.2.7 重组酵母pPIC9k-ugt73b6/GS115的构建

2.2.7.1 重组质粒p PIC9k-ugt73b6的线性化

2.2.7.2 毕赤酵母GS115感受态细胞的制备及转化

2.2.7.3 筛选遗传霉素抗性转化子

2.2.7.4 酵母重组子PCR鉴定

2.2.8 重组型毕赤酵母的诱导表达

3.结果

3.1 ugt73b6基因序列扩增

3.2 阳性转化子PMD-ugt73b6的鉴定

3.3 重组载体p PIC9k-ugt73b6鉴定结果

3.4 表达菌株的转化及表达结果

3.4.1 毕赤酵母转化子的遗传霉素筛选

3.4.2 重组菌株的PCR鉴定结果

3.4.3 酵母重组子的诱导表达结果

4.讨论

第五章结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

致谢

附录I

附录II

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 江灵敏

导师: 谭朝阳

关键词: 苯乙醇苷类化合物,生物转化,基因克隆,真核表达

来源: 湖南中医药大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 湖南中医药大学

分类号: Q78

DOI: 10.27138/d.cnki.ghuzc.2019.000124

总页数: 86

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