胭脂鱼IgM单克隆抗体的制备及应用研究

论文摘要

胭脂鱼（Myxocyprinus asiaticus）,又称紫鳊、木叶盘、火排等,隶属于硬骨鱼纲（Osteichthyes）、鲤形目（Cypriniformes）、胭脂鱼科（Catostomidae）、胭脂鱼属,主要分布于长江和闽江水系。其外观美丽、肉嫩味鲜,具有较高的观赏价值和经济价值。但是,人为滥捕、水体环境污染等原因导致胭脂鱼的数量逐年下降。目前胭脂鱼已被投放于人工水产养殖中,随着养殖规模的扩大,病害也在逐步增加,这不仅给养殖者带来经济损失,还阻碍了胭脂鱼养殖业的健康发展。基于鱼类免疫系统及其作用机制的免疫治疗和预防策略因其安全和有效性逐渐受到重视。作为最低等的脊椎动物,鱼类兼具非特异性免疫和特异性免疫,特异性免疫又包括体液免疫和细胞免疫,免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）是启动鱼类体液免疫应答的主要分子。硬骨鱼类中有3个Igs同种型:IgM、IgD和IgZ/IgT。其中,IgM是适应性体液免疫中最早出现的抗体,是机体抗感染的“先头部队”。因此,研究胭脂鱼IgM的结构与功能、组织中IgM蛋白表达水平和血清IgM免疫应答规律等内容,不仅可以为胭脂鱼的免疫预防与治疗策略制定提供理论基础,而且能进一步丰富硬骨鱼类免疫机制的认识。本文研究内容主要包括以下几方面:1)以Protein A亲和层析纯化的胭脂鱼血清IgM作为免疫原免疫Balb/c雌性小鼠,制备小鼠抗胭脂鱼IgM血清,并通过细胞融合技术获得分泌抗胭脂鱼IgM单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为1-C6A12。间接ELISA和Western blotting结果表明:小鼠抗胭脂鱼IgM血清和单克隆抗体1-C6A12均能识别胭脂鱼IgM中分子量为68 kDa的重链,而与草鱼、鲫鱼、尼罗罗非鱼和南方鲇四种硬骨鱼类全血清无交叉反应。2)利用单克隆抗体1-C6A12分析胭脂鱼各组织与体液中IgM蛋白表达水平。Western blotting结果表明:胭脂鱼IgM蛋白在肾、脾、头肾、鳃、肠、皮肤、肝、心脏、腹腔细胞、外周血淋巴细胞、血清、腹腔液、肠粘液、胆汁和体表黏液中均有表达,其表达量在血清中最高,在腹腔液、肾、脾脏、头肾、鳃和肠中较高,在肠黏液、胆汁、体表黏液、皮肤、腹腔细胞和外周血淋巴细胞中较低,在肝和心脏中极低,在肌肉、脑和性腺中未检测到IgM蛋白。间接ELISA结果显示:胭脂鱼五种体液中IgM蛋白表达水平为血清>腹腔液>肠黏液>体表黏液>胆汁,与Western blotting检测到的结果一致。3)利用单克隆抗体1-C6A12检测胭脂鱼外周血、头肾、腹腔和脾脏中mIgM+淋巴细胞百分比。间接免疫荧光实验（IFA）结果表明:单克隆抗体1-C6A12可以识别胭脂鱼mIgM分子。流式分析结果显示:胭脂鱼外周血、头肾、腹腔和脾脏中mIgM+淋巴细胞百分比分别为15.9%、10.7%、4.32%、4.16%。4)利用单克隆抗体1-C6A12检测胭脂鱼脾脏、腹腔、头肾和外周血中具有吞噬功能的mIgM+淋巴细胞百分比。IFA结果表明:胭脂鱼外周血、头肾、腹腔和脾脏中可观察到mIgM+淋巴细胞对嗜水气单胞菌的吞噬。流式结果显示:胭脂鱼脾脏、腹腔、头肾和外周血中具有吞噬功能的mIgM+淋巴细胞百分比分别为2.06%、1.95%、1.42%、0.976%。5)利用基于生物素化单克隆抗体1-C6A12建立的三抗体夹心ELISA法（TAS-ELISA）探究嗜水气单胞菌免疫胭脂鱼血清菌特异性IgM的免疫应答规律。本实验通过腹腔注射和浸泡两种方式免疫胭脂鱼,TAS-ELISA结果显示:浸泡组和腹腔注射组IgM效价均高于PBS组,腹腔注射组IgM效价高于浸泡组,注射组IgM效价高峰值为29,浸泡组IgM效价高峰值为26。浸泡组初次免疫后的14-30 d血清IgM效价为25,30-41 d血清IgM效价呈上升趋势,41-64 d血清IgM效价达到高峰;腹腔注射组初次免疫后的14-30 d和41-48 d血清IgM效价呈上升趋势,48-64 d血清IgM效价达到高峰。本文用纯化的胭脂鱼血清IgM免疫小鼠,制备出单克隆抗体1-C6A12。采用间接ELISA和Western blotting对单克隆抗体1-C6A12进行鉴定和特征分析。利用单克隆抗体1-C6A12分析胭脂鱼各组织和体液中IgM蛋白表达水平,检测胭脂鱼外周血、头肾、腹腔和脾脏中mIgM+淋巴细胞和具有吞噬功能的mIgM+淋巴细胞百分比,探究嗜水气单胞菌免疫胭脂鱼血清菌特异性IgM的免疫应答规律。该单克隆抗体为研究胭脂鱼免疫系统提供了有力工具。

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英文缩略词

摘要

Abstract

第1章文献综述

1.1 胭脂鱼研究概况

1.1.1 胭脂鱼研究现状

1.1.2 胭脂鱼常见疾病及防治

1.2 硬骨鱼类免疫系统研究概况

1.2.1 免疫组织和器官

1.2.2 免疫细胞

1.2.3 固有淋巴细胞

1.2.4 免疫球蛋白

1.2.5 黏膜免疫系统

1.2.6 黏膜免疫与系统免疫的关系

1.3 单克隆抗体在鱼类免疫学中应用

1.3.1 单克隆抗体在淋巴细胞研究中的应用

1.3.2 单克隆抗体在免疫球蛋白研究中的应用

1.4 研究目的与意义

1.5 研究内容

1.6 技术路线

第2章胭脂鱼血清IgM的纯化及其单克隆抗体的制备

2.1 引言

2.2 实验材料和仪器

2.2.1 实验动物与细胞

2.2.2 实验试剂

2.2.3 实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 胭脂鱼血清的制备

2.3.2 Protein A亲和层析

2.3.3 SDS-PAGE检测蛋白纯度及分子量

2.3.4 BCA法测定蛋白浓度

2.3.5 免疫小鼠

2.3.6 小鼠抗血清效价检测

2.3.7 小鼠抗血清特异性分析

2.3.8 抗胭脂鱼Ig M单克隆抗体的制备

2.3.9 胭脂鱼rIgM重组蛋白表达

2.3.10 间接ELISA检测单克隆抗体的特异性

2.3.11 Western blotting分析单克隆抗体的特异性

2.4 实验结果

2.4.1 SDS-PAGE检测Protein A亲和层析纯化结果

2.4.2 纯化产物蛋白浓度测定结果

2.4.3 小鼠抗血清效价ELISA检测结果

2.4.4 小鼠抗血清的Western blotting检测结果

2.4.5 阳性杂交瘤细胞筛选结果

2.4.6 单克隆抗体特异性检测结果

2.5 讨论

第3章胭脂鱼Ig M单克隆抗体的应用

3.1 引言

3.2 实验材料和仪器

3.2.1 实验动物

3.2.2 实验菌株

3.2.3 实验试剂

3.2.4 实验仪器

3.3 实验方法

3.3.1 胭脂鱼Ig M蛋白表达检测

3.3.2 间接免疫荧光实验（IFA）

3.3.3 流式细胞术分析

3.3.4 嗜水气单胞菌菌液的制备

3.3.5 FITC标记嗜水气单胞菌

3.3.6 胭脂鱼mIgM+淋巴细胞的吞噬检测

3.4 实验结果

3.4.1 胭脂鱼各组织和体液Ig M蛋白表达水平分析

3.4.2 胭脂鱼体液Ig M效价间接ELISA检测

3.4.3 胭脂鱼外周血、头肾、腹腔和脾脏中白细胞IFA分析

3.4.4 胭脂鱼外周血、头肾、腹腔和脾脏中mIgM+淋巴细胞百分比

3.4.5 FITC标记嗜水气单胞菌结果

3.4.6 胭脂鱼mIgM+淋巴细胞吞噬嗜水气单胞菌结果

3.5 讨论

第4章嗜水气单胞菌免疫胭脂鱼血清Ig M效价TAS-ELISA检测

4.1 引言

4.2 实验材料与仪器

4.2.1 实验动物

4.2.2 实验菌株

4.2.3 实验试剂

4.2.4 实验仪器

4.3 实验方法

4.3.1 Protein A亲和层析

4.3.2 纯化单克隆抗体的浓度及纯度检测

4.3.3 生物素标记纯化单克隆抗体及浓度测定

4.3.4 生物素化单克隆抗体合适稀释度的选择

4.3.5 嗜水气单胞菌免疫胭脂鱼

4.3.6 免疫鱼血清Ig M效价检测

4.4 实验结果

4.4.1 纯化单克隆抗体1-C6A12 纯度及浓度结果

4.4.2 生物素化单克隆抗体合适稀释度的确定

4.4.3 免疫胭脂鱼血清Ig M效价检测结果

4.5 讨论

全文结论

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吴霞

导师: 张小萍

关键词: 胭脂鱼,单克隆抗体,淋巴细胞,嗜水气单胞菌

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 西南大学

分类号: Q95;Q813.2

总页数: 68

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