杆状病毒DNA聚合酶入核机理的初步研究

论文摘要

杆状病毒（Baculovirus）是一类特异感染节肢动物的病原微生物,它的基因组是双链超螺旋环形结构,全长约80至180 kb,通常编码89到183个基因。DNA复制是病毒增殖周期中最重要的事件。病毒一旦感染昆虫细胞,病毒粒子便释放DNA进入细胞核,病毒DNA在细胞核的病毒发生基质内开始复制。杆状病毒的DNA聚合酶（DNA polymerase,DNApol）作为病毒复制的关键酶,在细胞核内参与了病毒的复制,但是DNApol在细胞质翻译后是怎样被转运到细胞核这一过程仍不清楚。本研究通过分析β杆状病毒属菜粉蝶颗粒体病毒（Pieris rapae granulovirus,PiraGV）DNApol的核定位信号（Nuclear localization signal,NLS）,以及DNApol与宿主蛋白的相互作用,深入揭示杆状病毒蛋白入核的分子机理。本论文研究结果如下所示:生物信息学分析显示PiraGV N末端有一个潜在的NLS（4LFKRKLDEPPTPTHHTLVKAIKLS 25）,其既不匹配于经典单分型NLS,也没有与二分型NLS一致性的保守序列。将PiraGV的NLS与绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP）融合后能够定位到细胞核,证实这段序列具有NLS的功能。多点突变分析证实NLS基序中的碱性氨基酸序列6KRK8以及20KAIK23对蛋白的入核是必不可少的。为了鉴定PiraGV DNApol的NLS能否替代α杆状病毒属斜纹夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,SpltNPV）DNApol的NLS功能,将SpltNPV DNApol中的NLS替换为PiraGV DNApol NLS,构建了质粒pBlue-HA:SlpolΔnls:Prnls,将质粒pBlue-HA:SlpolΔnls:Prnls转染到Sf9细胞,24h后免疫荧光分析发现NLS替代的SpltNPV DNApol不能够定位到细胞核,而是定位在细胞质。将PiraGV DNApol NLS替代的SpltNPV dnapol转座进没有dnapol的AcMNPV Bacmid中,构建了重组病毒Bac-AcΔpol:SlpolΔnls:Prnls。蛋白定位分析显示NLS替代的SpltNPV DNApol也分布在细胞质中。病毒增长曲线显示在重组病毒Bac-AcΔpol:SlpolΔnls:Prnls转染Sf9细胞120h后病毒滴度和野生型SpltNPV DNApol重组病毒Bac-AcΔpol:Slpol相比减少了2600倍;实时定量PCR分析显示在转染24h后重组病毒Bac-AcΔpol:SlpolΔnls:Prnls基因组的拷贝数相比Bac-AcΔpol:Slpol减少19倍;在Bac-AcΔpol:SlpolΔnls:Prnls转染的细胞中没有产生多角体,而Bac-AcΔpol:Slpol转染的细胞产生的多角体占转染细胞总数的3.1%。这些结果证实在SpltNPV DNApol中NLS的替换导致了感染性子代病毒的减少、病毒DNA复制产量降低以及病毒多角体的减少。为了深入地揭示杆状病毒DNApol入核的分子机制,将不同时间点野生型AcMNPV感染Sf9细胞进行转录组学分析,在注释的序列中鉴定了四个核输入蛋白α（Importinα）的同源蛋白,结果显示SfIMA1/2,SfIMA4和SfIMA7与人类Importinα1,Importinα4和Importinα7分别有46%/26%、69%和64%的氨基酸序列同源性,其中SfIMA1,SfIMA4和SfIMA7显示了典型的Importinα家族蛋白的特征,包括在N端存在一个保守的IBB结构域（Importin beta binding domain,IBB）、8个ARM（Armadillo domain,ARM结构域）重复序列以及C末端的Arm重复序列。亚细胞定位分析表明SfIMA1,SfIMA4和SfIMA7均能定位到Sf9细胞的核膜。酵母双杂交实验证实SfIMA1,SfIMA4以及SfIMA7能与带有核定位信号的AcMNPV DNApol C末端相互作用。双分子荧光互补（Bimolecular fluorescence complementation,BIFC）实验进一步证实SfIMA1或SfIMA4或SfIMA7在Sf9细胞中与AcMNPV DNApol C末端共表达都有荧光互补现象。这些结果表明SfIMA1,SfIMA4和SfIMA7这三个核输入蛋白参与了AcMNPV DNApol核输入过程。

论文目录

摘要

Abstract

缩略词

第1章绪论

1.1 引言

1.2 杆状病毒的研究进展

1.2.1 杆状病毒的分类

1.2.2 杆状病毒的复制

1.2.3 杆状病毒的基因组研究

1.2.4 杆状病毒的应用

1.3 菜粉蝶颗粒体病毒

1.3.1 菜粉蝶颗粒体病毒

1.3.2 菜粉蝶颗粒体病毒的基因组

1.3.3 菜粉蝶颗粒体病毒的DNA聚合酶

1.4 核质转运研究进展

1.4.1 核定位信号

1.4.2 核输入蛋白

1.4.3 输入蛋白介导的核质转运分子机制及调控方式

1.5 研究内容与意义

第2章 PiraGV DNA聚合酶NLS的预测和鉴定

2.1 实验材料

2.1.1 菌株、质粒、细胞和病毒

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 杆状病毒DNApol NLS序列分析

2.2.2 热激感受态的制备及转化

2.2.3 电转感受态的制备和转化

2.2.4 分子克隆

2.2.5 细胞的培养与传代

2.2.6 病毒转染及荧光观察

2.2.7 转染上清感染Sf9 细胞

2.2.8 测定病毒滴度

2.2.9 荧光定量PCR

2.2.10 质粒DNA的转染

2.2.11 免疫荧光

2.2.12 GFP与短肽融合表达质粒的构建

2.2.13 NLS的定点突变

Δnls：Prnls)的构建'> 2.2.14 PiraGVDNApol的 NLS基序替代SpltNPVDNApolNLS基序的重组Bacmid(Bac-AcΔpol：Slpol^{Δnls：Prnls})的构建

2.3 实验结果与分析

2.3.1 杆状病毒DNA聚合酶NLS的预测及比对结果

2.3.2 PiraGV DNA聚合酶NLS序列功能性证实

2.3.3 PiraGV DNApol NLS与 SpltNPV DNApol的比较

2.4 小结

第3章苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒DNA聚合酶和核输入蛋白的相互作用

3.1 实验材料

3.1.1 细胞和菌株

3.1.2 实验试剂

3.1.3 实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1 感染细胞总RNA的提取

3.2.2 转录组学分析

3.2.3 利用酵母双杂交方法鉴定蛋白互作

3.2.4 利用双分子荧光互补方法鉴定蛋白互作

3.3 实验结果与分析

3.3.1 RNA琼脂糖凝胶电泳检测图

3.3.2 转录组学分析结果

3.3.3 草地贪夜蛾输入蛋白α（Spodoptera frugiperda importinα）的亚细胞定位

3.3.4 草地贪夜蛾（S.frugiperda）输入蛋白α和Ac MNPV DNApolC末端的相互作用测定

3.4 小结

第4章结论和讨论

致谢

参考文献

个人简介

附表1 PCR引物

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李佩

导师: 王文凯,冯国忠

关键词: 杆状病毒,聚合酶,核定位信号,核输入蛋白

来源: 长江大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 长江大学

分类号: S852.65

总页数: 83

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