邻苯二甲酸二丁酯降解菌的分离及降解机理研究

论文摘要

邻苯二甲酸酯（Phthalic Acid Esters,PAEs）作为增塑剂被广泛应用于实际生活,其中邻苯二甲酸二丁酯（Di-n-butyl Phthalate,DBP）是最常用的PAEs之一。随着PAEs的生产、运输和废弃,PAEs逐渐渗入环境,对空气、水体、土壤和生物体都造成了严重的威胁。由于非生物降解PAEs具有局限性,所以微生物降解成为目前治理环境PAEs污染的主要途径,因此筛选具有PAEs高效降解能力的菌株,并应用于环境,对于PAEs造成的环境污染的生物修复具有重要意义。本研究从受石油严重污染的土壤中分离出来一株好氧、利用DBP生长的革兰氏阴性菌;经形态学,系统发育进化分析确定其属于Xanthobacter sp.（黄色杆菌属）,并命名为YC-JY1;通过生理生化实验,初步确定菌株YC-JY1可利用的物质和所含有的抗性基因。菌株YC-JY1降解特性实验结果显示,YC-JY1降解DBP的最适条件为30°C和pH 7.0,此时YC-JY1在5 d内可降解94%以上的100-400 mg/L DBP;对于更高浓度DBP的降解,YC-JY1可能需要更长时间;NaCl对YC-JY1降解DBP具有抑制作用,金属离子和表面活性的使用对YC-JY1降解DBP也有不同的促进或抑制。底物谱实验确定了YC-JY1可利用的邻苯二甲酸酯,其中100 mg/L的邻苯二甲酸二戊酯（Di-n-pentyl Phthalate,DPeP）,100 mg/L的邻苯二甲酸二己酯（Dihexyl Phthalate,DHP）和100 mg/L的邻苯二甲酸单丁酯（Monobutyl Phthalate,MBP）在5 d内的降解率均高于95%。通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）确定DBP中间降解产物为MBP和邻苯二甲酸（Phthalic Acid,PA）;由此推断,在YC-JY1的作用下,DBP的降解途径为:DBP首先水解为MBP,MBP继续水解最终生成PA。为了验证YC-JY1在实际生活中的应用潜能,我们进行了土壤模拟修复实验;实验结果显示YC-JY1在10 d内对三种不同类型土壤中DBP的降解率均在70%以上,在实际土壤环境中表现出良好的应用潜力。确定DBP的降解途径后,我们对其降解途径中关键基因进行了筛选。基于PAEs水解酶在菌株YC-JY1中的水解酶活性与类型实验,我们确定YC-JY1中的PAEs水解酶是一胞内诱导型水解酶,并且在菌株生长到对数期末时水解酶活性最高。依据已报道的PAEs酯酶基因设计引物对YC-JY1基因组进行扩增,并未发现含有已报道酯酶基因的同源序列,进而通过基因组文库构建筛选PAEs水解酶基因。通过基因组文库构建,我们从YC-JY1中克隆到一个水解酶基因dphC,并将其编码的氨基酸序列与已报道的PAEs酯酶序列进行序列比对和系统发育分析;结果表明DphC的氨基酸序列中含有“GXSXG”保守结构,并推测DphC可能是一个新的PAEs二酯酶。在进一步实验中,我们构建了水解酶基因dphC的重组表达载体并纯化重组蛋白;重组水解酶DphC在30°C、pH 8.0的条件下,相对酶活达到最高;DphC的底物谱实验说明,DphC能够降解多种邻苯二甲酸二酯,但不能降解DPrP和MBP;对于可降解底物,我们对其动力学参数进行了相应的计算;应用HPLC-MS分析DphC降解DBP的产物,只能检测到MBP,未检测到PA的存在。综上所述,我们可以确定水解酶DphC是一个新的PAEs二酯酶。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王嘉翼

导师: 闫艳春

关键词: 生物降解,邻苯二甲酸二丁酯,黄色杆菌,二酯酶

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 中国农业科学院

基金: 国家自然科学基金项目(31540067,21876201),中国农业科学院基本科研业务基金项目(1610042017001,1610042018005 和 1610042018006)

分类号: X592;X172

总页数: 77

文件大小: 3311K

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