姜发军[1]2004年在《黑曲霉提取物与水杨酸对长春花悬浮细胞生长及生物碱代谢作用的研究》文中研究表明在植物细胞培养过程中，添加诱导子是提高植物次生代谢有效的方法之一。本文以黑曲霉提取物和水杨酸作为诱导子就长春花细胞悬浮培养过程中诱导子与其相互作用关系及诱导子对生物碱代谢的影响等方面进行初步探讨，研究结果如下： 毛霉、木霉、青霉、黑曲霉及酵母提取物5种真菌诱导子处理均能提高长春花悬浮培养细胞中生物碱的含量。在长春花悬浮培养细胞对数生长末期加入浓度为300μg/mL黑曲霉诱导子，生物碱含量达到了666μg/gFW，是对照的1.6倍。 真菌诱导子能激发长春花悬浮培养细胞的防御性应答反应。产生氧进发，细胞的氧化还原态势发生了明显的变化，培养基发生碱化现象，膜脂过氧化产物MDA含量大幅提高，蛋白质含量提高，POD、CAT的活力出现波动性变化，并具有一定的时序性。同时，与生物碱代谢有关的PAL的活力得到提高。 真菌诱导后加入200mmol/L氯化钙能够加强诱导子的诱导效果，生物碱含量进一步提高，达到730μg/gFw；而10mmol/L EGTA和1mmol/L LaCl。抑制真菌诱导子的诱导效果，对生物碱含量没有影响。 通过添加不同浓度的水杨酸(SA)，比较它们对长春花细胞POD、PAL、H_2O_2含量及对细胞生长和生物碱含量的影响，结果表明，SA可提高POD及PAL的活性，促进细胞内H_2O_2含量的上升并有利于生物碱的合成，其中10mg/L水杨酸对生物碱合成的促进效果明显，生物碱含量为对照组的1.3倍。 经过300μg/mL黑曲霉诱导子(FO)，10mg/L水杨酸(SA)，300μg/mL黑曲霉诱导子+10mg/L SA 3种处理，对长春花悬浮细胞膜脂过氧化和生物碱合成的影响。结果表明：FO和SA单独处理细胞均引起长春花细胞膜脂过氧化。SA+FO联合处理可以减轻FO单独处理细胞所引起的膜脂过氧化程度。SA+FO联合处理与真菌诱导子处理相比，较大地提高了过氧化物酶及苯丙氨酸解氨酶的活性。3种处理方法均可提高长春花细胞生物碱含量，特别以FO+SA处理含量最高，达到700μg/gFw。结果显示：在真菌诱导子诱导与水扬酸的联合作用下提高生物碱含量，可能与水杨酸减轻真菌诱导子所引起的细胞膜脂过氧化程度有关。
牧文[2]2007年在《诱导子对喜树细菌中喜树碱含量及色氨酸脱羧酶活性的影响》文中研究指明水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJa)及乙烯利(Ethrel)等诱导子在植物抗逆性方面的作用越来越受到科学工作者的关注，它们可以作为细胞信使激活特定的防御基因的表达，从而诱导与植物抗逆相关的次生代谢产物的合成。喜树中的喜树碱(Camptothecin，CPT)作为一种次生代谢产物，可以对多种环境胁迫产生应答。因此，本试验研究了伤害及诱导子——SA、MeJa、Ethrel对喜树幼苗中喜树碱含量的诱导效应、诱导周期以及诱导物的适宜浓度，探讨诱导子对喜树碱合成的调控机制，以期为增加喜树碱产量提供有效途径。另外，通过研究诱导子与UV-B辐射复合处理后喜树幼叶中喜树碱含量及其合成途径中的关键酶——色氨酸脱羧酶(TDC)活性的变化规律，探讨诱导子缓解UV-B辐射伤害的可能机制，取得的主要结果如下：1．机械伤害及喷施诱导子——SA、MeJa、Ethrel均能在一定程度上增强喜树碱的合成，其中水杨酸处理和机械伤害诱导效果最明显，比对照分别提高了47.7％和27.2％，伤害与诱导子复合处理对喜树碱含量的诱导无协同效应，相反，机械伤害可以抑制诱导子的诱导作用。2．诱导作用受诱导剂的使用浓度的影响，SA、MeJa和Ethrel的适宜浓度分别为50～100 mg·L~(-1)、5～10 mg·L~(-1)、5～10 mg·L~(-1)。3．在喜树幼苗不同的发育时期，诱导作用不同。在子叶展开10d时用SA诱导可以使CPT含量提高106.3％，MeJa、Ethrel和伤害处理后含量也相应的增加了66.1％、70.2％和40.6％。在之后的发育时期进行诱导处理，诱导作用明显下降，这表明喜树次生代谢对诱导子的敏感期局限在生长发育的初始阶段。4．不同的诱导子均能在不同程度上影响喜树幼叶中TDC活性及CPT含量。UV-B辐射处理后TDC的活性较对照处理低，但后期幼叶中CPT含量却有升高趋势，表明植株对UV-B辐射的伤害已经产生了一定的防御反应。诱导子能迅速诱导幼叶中TDC活性显着升高，处理24h后，SA、MeJa、Ethrel诱导TDC活性分别升高了281％、514％、139％，随后，幼叶中CPT含量不断升高。5．SA、MeJa和Ethrel预处理均可以促进喜树次生代谢，从而缓解UV-B辐射对幼苗的伤害。SA、MeJa、Ethrel与UV-B辐射复合处理24h后，叁组叶片中的TDC活性较UV-B辐射组的分别了提高48％、13％、153％，且在72h后仍保持较高活性。同时，复合处理大大提高了喜树幼叶中的CPT含量，增长幅度依次为32.8％、59.2％、75.3％。6．单一诱导子处理时，TDC活性在24h时达到高峰，而CPT含量的峰值出现较晚；UV-B辐射与乙烯利复合处理时，叶片中TDC活性与CPT含量均在24h出现峰值，而UV-B辐射与水杨酸、茉莉酸甲酯复合处理后，TDC活性与CPT含量之间的没有明显关系。
李琰[3]2008年在《雷公藤组织培养生产次生代谢产物及其代谢调控研究》文中指出雷公藤是一种重要的杀虫植物和传统的中药材,近年来在医用和农用无公害新型杀虫剂等方面的需求不断增加,使野生雷公藤资源盲目的开采利用而急剧减少。为保护雷公藤自然资源,维护生态环境,实现雷公藤资源可持续利用发展和满足人们的需求,通过组织培养的方式来生产雷公藤的有用次生代谢产物,具有重要的实际应用价值。本研究以雷公藤一年生枝条扦插形成的根、茎、叶为外植体诱导愈伤组织,经多次继代培养后选择疏松型愈伤组织建立悬浮细胞系和不定根培养体系,探讨外植体、培养基各种成分、培养条件、前体物质、诱导子等对悬浮细胞、不定根的生长和雷公藤内酯醇及生物碱含量的影响。主要研究结果如下:1.雷公藤愈伤组织诱导及培养条件优化雷公藤的外植体种类、基本培养基类型、激素浓度及组合对愈伤组织诱导有显着的影响。根、茎、叶3种外植体均可诱导出愈伤组织,6种基本培养基中MS诱导率最高;单独添加2,4-D时以1.0 mg/L诱导率最高,为47.37%;单独添加NAA时以2.0 mg/L诱导率最高,为36.32%,生长素与细胞分裂素KT或6-BA的配合使用时明显提高出愈率,最佳培养基及激素组合为MS+1.0 mg/L 2,4-D +0.5~1.0 mg/L KT,愈伤组织诱导在90%以上。以3种不同来源的愈伤组织进行继代培养,研究愈伤组织生长与内酯醇及生物碱积累的关系,探讨基本培养基类型、激素浓度及组合、预防褐变等对愈伤组织生长及对内酯醇和生物碱含量的影响。结果表明,在连续继代多次后,根愈伤组织逐渐变的疏松、颗粒状,而茎、叶愈伤组织致密、呈块状,褐化严重。根愈伤组织增长量、内酯醇含量也明显高于茎、叶愈伤组织,而叶愈伤组织中生物碱的含量明显高于根、茎愈伤组织中的含量;7种基本培养基中6,7-V的愈伤组织增长量最大,White培养基有利于内酯醇和生物碱的积累,但愈伤组织增长量较低;不同浓度2,4-D、NAA及与KT、6-BA组合表明,1.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT明显促进愈伤组织生长和生物碱的形成,而4.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA有利于愈伤组织中内酯醇的合成;培养基中加入5~10 mg/LAgNO3,不仅能明显抑制愈伤组织褐变,也明显提高内酯醇含量。暗光培养的愈伤组织增长量、内酯醇及总生物碱含量均较高,且褐化程度较轻。培养到第50天愈伤组织增长量达到最大值,第55天时内酯醇含量达到最大值,生物碱含量随着培养时间的延长而升高。2.雷公藤悬浮培养体系的建立和优化及对内酯醇和生物碱含量的影响以根愈伤组织建立了悬浮系,研究基本培养基类型、继代时间、接种密度、pH值和添加7种氨基酸、10种非生物诱导子和7种前体物质对细胞的生长和内酯醇和生物碱含量的影响。悬浮细胞在NT培养基的增长量最高,MS适合进一步继代培养,在White培养基上内酯醇和总生物碱的含量最高;最佳接种密度为8~12 g/L,最适继代时间为30~35 d,培养55天时收获细胞。培养液pH值为5.8时,细胞增长量最大,内酯醇在pH值为6.4时最高,pH值为5.2时总生物碱最高。培养基中天冬氨酸、酪氨酸、精氨酸和丝氨酸的加入明显抑制雷公藤细胞的生长,且浓度越大抑制作用越强;加入苯丙氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸等在低浓度时能促进细胞的生长。7种氨基酸均能不同程度的促进内酯醇的合成,其中精氨酸1mmol/L和半胱氨酸2 mmol/L时,内酯醇含量较对照提高了3.2倍和2.8倍。除半胱氨酸明显抑制生物碱的合成以外,其他氨基酸的加入对雷公藤生物碱的合成均起不同程度的促进作用,其中蛋氨酸0.5 mmol/L时,雷公藤不仅生物碱含量较对照提高了1.5倍,内酯醇含量也较对照提高了2.3倍。非生物诱导子中,大豆蛋白、水杨酸、水解酪蛋白、谷氨酰胺、酸水解干酪素和甲醛抑制细胞的生长,矮壮素、乙酸钠、酵母提取物和苯甲酸钠在低浓度时对细胞的生长起促进作用。除酸水解干酪素抑制内酯醇的合成以外,其他均对内酯醇的合成起促进作用,其中谷氨酰胺2 mmol/L和大豆蛋白1 g/L时,内酯醇含量较对照提高了2.4倍和2.9倍。除水杨酸明显抑制生物碱的合成以外,其他诱导子的加入对雷公藤生物碱的合成均起促进作用,其中酵母提取物2 g/L时,雷公藤生物碱含量较对照提高了1.3倍。甲醛浓度为1.0 mL/L时,虽然细胞增长量仅为对照的77%,但内酯醇含量为对照的2倍,总生物碱含量为对照的1.2倍。前体物质中,除桂皮酸对雷公藤细胞的生长起抑制作用外,其他前体物质在低浓度时对细胞的生长起促进作用。除丙二酸抑制内酯醇的合成以外,其他前体物均对内酯醇的合成起促进作用,其中桂皮酸10 mg/L时,较对照提高了2倍;异戊二烯10 mL/L内酯醇为对照的2.5倍,总生物碱含量为对照的1.5倍,而细胞的增长量下降并不明显,为对照的96%。柠檬酸、桂皮酸和丙酮酸对雷公藤生物碱的合成起抑制作用,丙二酸、苹果酸和酒石酸在低浓度时对雷公藤生物碱的合成起促进作用,其中丙二酸浓度为2.0 mmol/L细胞内总生物碱含量为对照的2倍。3.雷公藤不定根培养体系的建立和优化及对内酯醇和生物碱含量的影响以悬浮细胞诱导不定根,建立不定根摇瓶培养体系,研究培养液中营养元素的消耗规律,探讨大量元素、微量元素、碳源及有机物和生物诱导子等对不定根生长和内酯醇及生物碱含量的影响。在悬浮细胞中,加入4.0 mg/L NAA,可诱导产生不定根,经过多代培养,形成了稳定的雷公藤不定根培养体系,检测不定根中内酯醇含量为悬浮细胞的2.1倍,为根皮粉中的4.5倍。经对NT培养基中大量元素的消耗动态研究,不定根进入快速生长期后,氮、磷、钾元素含量明显不足导致生长进入停滞期;当NO3-/NH4+与NT培养基一致并维持不变时,随着培养基中氮浓度的提高,雷公藤不定根增长量急剧上升,当总氮浓度为50 mmol/L时,增长量达到最大值。当总氮浓度为30 mmol/L时,内酯醇和总生物碱含量达最大值。在NO3-/NH4+为9︰1时,不定根增长量最大,内酯醇含量与NT培养基氮源比例基本一致时最高;只有铵态氮的情况下,不定根中总生物碱的含量为最高。不定根增长量随着PO43-、K+、Ca~(2+)和Mg~(2+)浓度的升高而升高;内酯醇含量在K+浓度为NT培养基的1.3倍时,Ca~(2+)浓度为NT培养基的2/3时,达到最大值,内酯醇含量随着PO43-浓度的升高而升高,NT培养基中Mg~(2+)浓度即可使内酯醇含量达到最大值;NT培养基中PO43-、K+、Ca~(2+)和Mg~(2+)浓度即可使总生物碱含量达到最大值。微量元素中,NT培养基中Fe~(2+)、Zn~(2+)和Cu~(2+)即可满足雷公藤不定根的生长,2倍Mn~(2+)浓度可使雷公藤不定根的生长量达最大值,在试验范围内,Na2MoO4浓度越高不定根增长量越高,培养基中缺乏H3BO3、KI和CoCI2不影响雷公藤不定根的生长;Fe~(2+)浓度为正常标准的1/3时,内酯醇和总生物碱的积累达到最大值;在试验范围内内酯醇和总生物碱的含量随Mn~(2+)浓度的升高而升高;Zn~(2+)盐浓度的2倍可使内酯醇的积累达到最大值,而生物碱的积累在该试验范围内随着Zn~(2+)盐浓度的升高而升高;Cu~(2+)盐浓度的2倍可使内酯醇和生物碱的积累达到最大值;H3BO3的加入对内酯醇及总生物碱的合成起抑制作用,浓度越高抑制作用越强;培养基中缺乏KI时不影响生物碱的合成,内酯醇的含量随着KI浓度的升高而升高;培养基中缺乏CoCI2并不影响内酯醇的合成,在NT培养基正常标准的2倍时,生物碱的含量最高;培养基中缺乏Na2MoO4有利于不定根中内酯醇和生物碱的合成,不定根中内酯醇和生物碱的含量随着钼酸钠浓度的升高而降低。碳源中,适合不定根生长、内酯醇形成的碳源为蔗糖,适合生物碱积累的碳源为葡萄糖;适合雷公藤不定根生长的蔗糖浓度为45 g/L,不定根中内酯醇和生物碱含量在蔗糖浓度为20 g/L时最高。7种有机物中,NT培养基中的正常标准的肌醇和VB1,即可使雷公藤不定根增长量、内酯醇及生物碱含量达到最大值。加入0.5 mg/L的烟酸可使内酯醇的含量达到最大值,但烟酸的加入对不定根中生物碱的合成明显的抑制作用,且浓度越高抑制作用越强。当VB6浓度为1mg/L,不定根增长量、内酯醇及生物碱含量达到最大值。在试验范围内,不定根增长量、内酯醇含量随着甘氨酸浓度的增加而升高,生物碱含量在甘氨酸浓度为1 mg/L时,达到最大值。叶酸和生物素的加入并不影响雷公藤不定根的生长,但在叶酸浓度为1 mg/L时,可使内酯醇及生物碱的含量达到最大值。生物素在0.5 mg/L时,内酯醇含量达到最大值,在1 mg/L时,生物碱的含量达到最大值。采用7种生物诱导子分别处理雷公藤不定根,均能促进不定根中内酯醇和生物碱的合成,并且对不定根的生长均没有明显影响,其中链霉菌和苹果炭疽病菌效果最好。经苹果炭疽病菌处理的雷公藤不定根中内酯醇的含量达88.65μg/gDW,为对照(39.62μg/gDW)的2.2倍,生物碱含量达6.09 mg/g DW,为对照(3.02 mg/gDW)的2倍。诱导子的作用效果与诱导子浓度、诱导子作用时间及不定根的生长状态有关。对苹果炭疽病菌来说,诱导子作用的最适浓度为每毫升培养基含糖100μg/mL;不定根在对数生长末期对诱导作用最敏感;在加入诱导子15 d后收获不定根,不定根中的内酯醇含量最高,而生物碱含量随诱导子作用时间的延长而提高。在不同体积的叁角瓶中,按叁角瓶体积的2/5加入培养液,随着叁角瓶体积的增大,雷公藤不定根增长量略有下降, 1 L和5 L的叁角瓶中不定根增长量分别下降2.92%和6.57%,而不定根和培养液中的内酯醇及生物碱含量差异不明显。内酯醇和生物碱均为分泌型,在过滤不定根后的培养液中内酯醇占每瓶内酯醇总量的56%,总生物碱占每瓶总量的65%。4.雷公藤组培产物有效成分含量测定及杀虫活性研究建立了在同一提取物中同时测定雷公藤内酯醇和总生物碱的方法。内酯醇的检测范围为1~100μg/ mL,(R2= 0.9999);雷公藤总生物碱在5-100μg/ mL范围内线性关系较好(R2= 0.9998);在同一提取液中,雷公藤内酯醇和总生物碱的加样回收率分别为100.72%(RSD=0.975%)、100.33%(RSD=2.56%)。不同组织培养产物提取液对3龄小菜蛾的生长均有明显的抑制和毒杀作用,其中不定根培养物提取物处理后每天的小菜蛾体重增加量均成了负值,72 h后70%左右已经死亡,存活的试虫体重比试验前下降了18.33%。5.雷公藤再生体系建立及组培快繁研究以雷公藤胚性愈伤组织为材料,研究了体细胞胚的发生过程和植株再生、芽苗增殖的影响因素。组织学观察表明,雷公藤体细胞胚起源于愈伤组织内部的单细胞,发育历程与合子胚相似。在愈伤组织再生中,NAA较2,4-D效果好, 6-BA优于KT,NAA与6-BA配合使用明显提高再生率。6种培养基中,MS和B5的愈伤组织再生率达100%,在0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA的MS培养基上,不仅愈伤组织再生率达100%,而且每块愈伤组织平均形成芽数也比较多。胚性愈伤组织在继代培养过程中,植株再生率和愈伤组织分化形成的小苗数,经历了一个由低到高再到低的过程。以继代八个月到一年之间的胚性愈伤组织的再生能力最强,达100%。雷公藤胚性愈伤组织在继代20个月后已经丧失分化能力。再生苗茎段增殖以1/2MS+2.0 mg/L IBA为好,生根培养以1/2MS+2.0 mg/L IBA+0.5 g/L活性炭较好,生根率达100%。移栽至珍珠岩与腐殖质土(1︰1)的混合基质中成活率达96%。
林艳君[4]2015年在《真菌诱导子对铁皮石斛原球茎生物碱含量影响及其机理》文中提出铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是兰科石斛属多年生附生草本植物,是一种兼具观赏价值与药用价值的中草药。本文选用铁皮石斛原球茎为材料(产地为福建连城),对原球茎离体培养条件进行优化,并以此为基础测定不同浓度和处理时间尖孢镰刀菌诱导子处理下铁皮石斛原球茎总生物碱含量的变化。同时克隆了两个调控生物碱合成途径相关酶的基因——DoHDR基因和DoIspF基因,并进行了基因相对表达量分析。1铁皮石斛离体培养条件优化以连城铁皮石斛为材料,优化铁皮石斛离体培养条件。①对比水杨酸、蛋白胨和番茄汁对铁皮石斛原球茎增殖的影响,结果显示,当水杨酸浓度为2 mg/L时原球茎增殖效果最好,但原球茎生长状态不好。蛋白胨浓度为2 mg/L时最有利原球茎增殖,番茄汁添加量为100 ml/L时原球茎增殖效果最好,且原球茎生长旺盛。②比较几组不同混合有机添加物对铁皮石斛原球茎增殖的影响,采用的添加物组合分别为香蕉和土豆、苹果和土豆、香蕉和苹果、番茄和土豆。结果表明添加50g/L土豆增殖效果最好③比较不同容器和培养方式对原球茎增殖的影响,结果表明,采用叁角瓶液体振荡培养最有利原球茎增殖。2真菌诱导子对铁皮石斛总生物碱含量的影响基于优化的离体培养条件下所得到的大量原球茎,比较不同浓度不同处理时间尖孢镰刀菌诱导子对铁皮石斛总生物碱的影响,结果发现当诱导子浓度较低时(100mg/L,200mg/L),总生物碱含量随处理时间增加呈先上升后下降的趋势,当诱导子浓度较高时(500 mg/L),总生物碱含量先下降后上升,而当诱导子浓度过高时(1000 mg/L)总生物碱合成受到抑制,含量都比较低。而最适宜生物碱合成与积累的条件为200 mg/L诱导子处理3天,总生物碱含量最高。3铁皮石斛HDR基因和IspF基因的克隆和生物信息学分析以铁皮石斛原球茎为材料采用同源克隆与RACE相结合的方法,得到铁皮石斛MEP途径的2个基因——DoHDR和DoIspF,DoHDR全长1784 bp,包含完整ORF,长度为1382 bp,编码460个氨基酸,生物信息学分析表明该基因编码的蛋白为稳定的酸性亲水蛋白,不具有跨膜结构,不含信号肽,二级结构预测表明,该蛋白主要含有α-螺旋、p-折迭和无规则卷曲。该蛋白共有20个磷酸化位点,其中有7个丝氨酸(Ser)磷酸化位点,苏氨酸位点(Thr)7个,酪氨酸位点(Tyr)6个。该蛋白最有可能定位于内质网膜,属于lytB_ispH超家族,该蛋白与单子叶植物兰科蝴蝶兰亲缘关系最近。本研究得到的另外一条基因DOIspF基因全长891 bp,含有完整ORF为785 bp,编码260个氨基酸,编码的蛋白为不稳定水溶性蛋白,不含跨膜结构不含信号肽,最有可能定位于叶绿体类囊体膜上,二级结构预测结果表明该蛋白含有较多无规则卷曲,以及较少的α-螺旋和p-折迭,IspF蛋白共有15个磷酸化位点,其中丝氨酸位点(Ser)9个,苏氨酸位点(Thr)5个,酪氨酸位点(Tyr)1个。蛋白质功能位点预测结果表明该蛋白属于MECDP合酶超家族,该蛋白与单子叶植物纲禾本科植物玉米亲缘关系最近。4真菌诱导子处理下生物碱合成相关基因DoHDR与DoIspF基因相对表达量分析①尖孢镰刀菌诱导子处理下DoHDR基因相对表达量分析。当诱导子浓度偏低(100 mgL)或者偏高(500 mg/L)时,HDR基因相对表达量变化趋势与未添加诱导子时一致,随着处理时间增长呈先上升后下降的趋势,峰值出现在处理5天时,当诱导子浓度为200 mg/L时,HDR基因仍然呈先上升后下降的趋势,但峰值出现在处理3天时,当诱导子浓度过大时(1000 mg/L),HDR基因表达受到抑制,与生物碱含量的趋势大致上相符,推测HDR基因与生物碱含量呈正相关。②尖孢镰刀菌诱导子处理下DoISpF基因相对表达量分析。未添加诱导子时,DoIspF基因表达量随时间逐步上升,当诱导子浓度为100 mg/L、200 mg/L、500 mg/L时DolspF基因相对表达量均为先上升后下降的趋势,当诱导子浓度为1000 mg/L时,基因表达量大致呈逐步下降趋势。
曾杨[5]2008年在《黑曲霉诱导子和水杨酸对虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的影响》文中认为本研究以多年生草本植物虎杖的幼嫩茎段为外植体,以其诱导出的愈伤组织为材料,通过添加黑曲霉诱导子和水杨酸,研究虎杖愈伤组织的白藜芦醇合成过程中诱导子对其影响。主要研究结果如下:(1)诱导子筛选用黑曲霉、青霉和灰葡萄孢的粗体物为诱导子,对愈伤组织进行诱导,结果表明,这叁种诱导子均对白藜芦醇的积累有一定的促进作用,其中黑曲霉诱导子对白藜芦醇的促进作用最为显着,比对照提高了50.2%。(2)黑曲霉诱导子对白藜芦醇含量的影响对黑曲霉诱导子浓度、加入时间、诱导培养时间进行筛选。结果表明,当在接种后第14d加入100mg/L的黑曲霉诱导子,诱导6d的效果最好,可以使处理中白藜芦醇的含量比对照高2.25倍。(3)水杨酸对白藜芦醇含量的影响通过对水杨酸添加浓度、加入时间、诱导培养时间的筛选,发现在接种后第14d加入7mg/L的水杨酸,诱导6d的效果最好,可以使白藜芦醇比对照高近1倍。(4)黑曲霉诱导子、水杨酸、苯丙氨酸协同作用对白藜芦醇含量的影响通过添加黑曲霉诱导子、水杨酸、苯丙氨酸的不同组合,发现各组合对白藜芦醇的合成均有一定促进作用,黑曲霉诱导子-水杨酸-苯丙氨酸组合对白藜芦醇的积累效果最好。(5)黑曲霉诱导子活性成分对黑曲霉诱导子成分进行分离,结果表明经多糖组处理后的诱导子大大提高了愈伤组织中白藜芦醇的合成能力,经其处理后的白藜芦醇的相对含量高于对照及其他处理。而经蛋白质组处理后的诱导子对愈伤组织中白藜芦醇的合成有轻微的抑制作用。(6)内源脱落酸含量通过对黑曲霉诱导子处理中ABA含量的测定,发现诱导处理中的ABA先呈急剧上升趋势,在第4d达到峰值,随后呈缓慢下降趋势,而对照中的ABA在整个过程都呈缓慢上升趋势,ABA在处理的整个过程都大于对照。(7)苯丙氨酸裂解酶活性通过对处理中PAL活性进行测定发现,对照和处理的PAL活性变化趋势一致,均是先上升后下降,处理的PAL活性大于对照。在处理中,诱导前4d PAL活性迅速增加,此后又快速下降,在第4d达到峰值。对照中PAL活性先缓慢上升,然后下降,在第6d达到峰值。(8)过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧物岐化酶活性添加黑曲霉诱导子对这叁种酶活性都有一定影响。对处理中POD活性的测定结果表明,处理和对照的变化趋势不同,处理的变化趋势为降-升-降-升-降趋势,对照呈略升-降-升的趋势;对CAT活性的测定结果表明,对照和处理的变化趋势基本一致,呈升-降-升-降的趋势;对SOD活性的测定结果表明,处理和对照的变化趋势不同,处理的变化趋势为降-升-降-升-降,对照的为降-升-降。
孙健玲[6]2010年在《半夏的快繁及诱导子对其愈伤组织总生物碱积累的影响》文中研究说明半夏Pinellia ternata ( Thunb ) Breit是天南星科半夏属的多年生草本药用植物,其块茎为传统的中药材。半夏中的总生物碱是评价药材质量的重要指标和主要有效成分,生物碱在众多的化学成分中具有明显的生物活性和生理功能,具有镇咳、祛痰、降压、健脾胃、止呕吐、降脂、抗心律失常、抗坏血栓以及抗肿瘤和提高记忆之功效,在我国治癌史上有着广阔的前景。由于半夏受繁殖方法和速度的影响,长期依赖采集野生半夏块茎入药的状况,导致野生资源日益枯竭,市场野生货源常供不应求。本文对半夏的化学成分和药理活性进行了总结,对药品野生资源的开发和利用进行了阐述,并对半夏的发展前景提出自己的见解。研究不同植物激素配比对半夏快繁的影响,继代的愈伤组织生长周期和生理生化指标的变化,以及单因素诱导子和双因素诱导子协同作用对半夏细胞的生长和总生物碱积累的影响,为提高半夏有效活性成分的含量,培育半夏优良品系提供基础,并获得以下结果:1.不同植物激素配比对半夏组织培养的影响。将半夏的外植体消毒后接种于不同浓度激素组合的MS培养基上,均能产生愈伤组织。MS添加1.5 mg/L 6-BA和0.3 mg/L 2,4-D对半夏愈伤组织诱导效果最好;MS+1.0 mg/L 6-BA和0.4 mg/L 2,4-D时比较适合半夏愈伤组织增殖,且愈伤组织生长状况较好,增殖快;1.0 mg/L或2.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L-0.5 mg/L NAA时比较适合半夏愈伤组织的出芽和生根,且植株的生长状况良好,每株的出芽数和生根数都较多。利用植物的组织培养技术,建立半夏的快繁体系,目的是提高半夏繁殖系数、加快生产周期和提供优质种苗。2.半夏愈伤组织生长周期中生理生化特征的变化。半夏愈伤组织的最佳收获时间30天,细胞的生长曲线呈现“S”形,分为延滞期、对数生长期和稳定期;半夏的愈伤组织在生长的前几天,细胞活力,可溶性蛋白含量,苯丙氨酸解氨酶活性基本保持稳定,在15-20天左右达到最高峰,后期又呈现缓慢降低的趋势;总生物碱含量在0-10天变化很小,在10-30天持续稳定的增长,30-35天呈现小幅度下降的趋势。生理生化指标反映细胞的生长状况,通过研究植物的生理生化指标,了解次级代谢产物的可能途径。3.不同诱导子及协同作用对半夏细胞生长和总生物碱积累的影响。研究了单因素诱导子(Ag~+,Cu~(2+),SA,苯丙氨酸,酪氨酸,木霉提取物,酵母提取物)和双因素诱导子(Ag~+和苯丙氨酸,Cu~(2+)和苯丙氨酸,Ag~+和酪氨酸,Cu~(2+)和酪氨酸,Ag~+和木霉提取物,Cu~(2+)和木霉提取物)对半夏细胞生长和总生物碱含量积累的影响。非生物诱导子在低浓度时,对细胞的生长影响不显着,在高浓度时抑制细胞的生长;各种浓度的苯丙氨酸、酪氨酸、木霉提取物和酵母提取物都有利于半夏细胞的生长,1.0 mg/L Cu~(2+)、30 mg/L木霉提取物对细胞总生物碱的积累影响极显着。最后,对药用植物的次生代谢进行了总结,对出现的问题进行了探索,同时对今后的研究方向也作了展望。4.半夏高生物碱愈伤组织的筛选。通过单因素诱导子及协同作用对半夏细胞生长和总生物碱积累的影响,筛选出生物碱含量高的愈伤组织,将其进行继代,直到生物碱的含量稳定,筛选出稳定的高生物碱的愈伤组织,为培育优良品种提供基础。30 mg/L木霉提取物,1 mg/L Cu~(2+)和20 mg/L木霉提取物的愈伤组织总生物碱含量显着,经5代转接后生物碱含量基本保持稳定,总生物碱含量分别为394.7μg/g和448.8μg/g,分别是对照的1.8倍和2.0倍。
肖文娟[7]2012年在《环境胁迫对欧洲花楸悬浮细胞生物量及次生代谢产物积累的影响》文中认为药用植物次生代谢产物的合成受到各种环境因子的调控,有研究表明环境胁迫能促进次生代谢产物的积累。但是,植物本身是一个复杂的系统,存在多种环境反应或调控机制,所以用植株进行次生代谢产物研究存在一定困难。药用植物的细胞培养在一定程度上解决了这个问题,起到了降阶降维的作用。欧洲花楸悬浮细胞因其生长迅速、反应灵敏,常用于研究联苯类次生代谢产物。本课题以欧洲花楸Sorbus ccuczpcrricz L的悬浮细胞为研究对象,通过测定细胞生物量及次生代谢产物的变化趋势,就非生物诱导子重金属及生物诱导子酵母提取物对欧洲花楸悬浮细胞的影响进行研究。主要研究内容包括：1、欧洲花楸悬浮细胞生长曲线培养研究2、非生物诱导子重金属对欧洲花楸悬浮细胞生物量及次生代谢产物合成和积累的影响研究3、生物诱导子酵母提取物对欧洲花楸悬浮细胞的影响研究4、复合诱导子重金属及酵母提取物对欧洲花楸悬浮细胞的影响研究结果：1、本实验测定了欧洲花楸悬浮细胞在正常培养条件下的生长20d的生长周期及细胞悬浮液的pH值,确定了欧洲花楸悬浮细胞的生长周期。欧洲花楸悬浮细胞在培养至14d时,细胞鲜重达到最大值,在培养的1-5d内,细胞处于延滞生长期；5-14d内,细胞处于指数生长期；14-20d内,细胞处于生长平台期。在正常培养条件下,细胞悬浮液的pH值的变化趋势是越来越大。利用细胞的鲜重和干重分别对欧洲花楸悬浮细胞的进行生长曲线的拟合,结果表明Logistic函数的R2值最大,为0.969,表明该函数拟合度很高,能够描述欧洲花楸悬浮细胞生长曲线的变化。拟合得到的函数是f(x)=5.044/(1+23,34*exp(-0.3887*x))。对该函数求一阶及二阶导数,得到了欧洲花楸悬浮细胞在8d时,细胞的生长速率最大；在5d时,生长加速度最大。细胞生长至第5d时,是细胞指数生长的前期,在此时期可对细胞进行诱导子处理。2、用重金属来诱导欧洲花楸悬浮细胞,考察细胞在处理后生物量及次生代谢产物的变化情况。结果表明,镧、铜、铅诱导子对细胞生物量都有不同程度的影响。当镧诱导子浓度在1μg/L-10mg/L之间时,对细胞生物量表现为刺激作用,刺激作用的大小呈现出中间浓度高,两端浓度低的变化趋势,镧对细胞生物量刺激作用最大的浓度为10μg/L(P<0.05)。铜诱导子对细胞生物量的影响和诱导时间相关,铜的0.05mg/L浓度对细胞生物量一直表现为抑制作用。低浓度在诱导时间<96h时,表现为抑制作用,之后则表现为促进作用,高浓度在诱导时间<96h时,表现为促进作用,之后则表现为抑制作用,铜对细胞生物量刺激作用最大的浓度为50mg/L(P<0.05)。铅浓度中0.5mg/L、5mg/L、50mg/L对细胞生物量表现为刺激作用(P<0.05)。在镧、铜、铅诱导下欧洲花楸悬浮细胞没有合成成次生代谢产物。3、用酵母提取物来处理欧洲花楸悬浮细胞,研究其对细胞生物量、次生代谢产物、细胞悬浮液pH值及细胞内可溶性蛋白质含量的变化。结果表明,在YE的诱导下,欧洲花楸悬浮细胞的生物量表现出下降的趋势,细胞生物量理论值和实际值之间的差值随着诱导时间的延长而增大；细胞悬浮液的pH值表现出下降的趋势；在诱导后的12h时,欧洲花楸悬浮细胞内即可检测到aupuparin,细胞内次生代谢产物的浓度随诱导时间而变化；处理细胞中的可溶性蛋白质含量高于对照组,在诱导时间<96h时,其含量是对照的50%,当诱导时间>96h时,其含量是对照的144%(P<0.05)。4、在镧+YE的复合诱导子处理下,镧诱导子的低浓度和高浓度对细胞总生物量是有增加的刺激作用,浓度为0.1μg/L、20mg/L的镧和10mg/L的铜对YE诱导子对细胞生物量的抑制有拮抗作用。镧+YE、铜+YE、铅+YE影响联苯类物质的方式和程度与的浓度密切相关,其影响方式为：刺激或抑制次生代谢物的合成含量；使处理细胞合成某种化合物的最大值显着高于YE单独诱导；提前在YE诱导时合成某一化合物的峰值时间。其中,铜+YE处理细胞内化合物合成的浓度表现出和铜诱导子浓度相关,随着铜浓度升高而升高或下降,这种相关且和诱导时间有关；铅+YE处理细胞内化合物合成的浓度表现出和铅诱导子浓度相关,其中是呈现出V字形变化趋势,最低点是YE+0.5mg/L；另外是随着铅浓度增大,化合物的浓度也随之增大。结论：1、通过对欧洲花楸悬浮细胞生长特性的研究,得到了欧洲花楸悬浮细胞的生长函数符合logistic曲线,该函数为f(x)=5.044/(1+23.34*exp(-0.3887"x)),细胞在14d时进入增长平台期,在8d时生长速率达到最大,在细胞生长至第5d时可添加诱导子进行处理。2、重金属诱导子镧、铜、铅的处理浓度对欧洲花楸悬浮细胞的生物量均有不同程度的影响,这种影响程度与诱导子浓度及诱导时间长短有关。整体上随着浓度增加,镧对细胞鲜重表现为抛物线形,铜、铅表现为U形曲线,对细胞生物量促进作用最大的浓度分别为镧10μg/L、铜50mg/L、铅0.5mg/L。但是这叁种诱导子在所有实验浓度下都不能直接诱导欧洲花楸悬浮细胞合成联苯类物质。3、酵母提取物能够快速诱导欧洲花揪悬浮细胞产生联苯类物质,经鉴定化合物为：2'-OH-aucuparin,3,5-dihydroxy-biphenyl, noraupuparin, aucuparin, eriobofuran。欧洲花楸悬浮细胞对YE具有特异性反应,当细胞受到胁迫时,细胞会启动抗胁迫途径来应对逆境。发现欧洲花楸次生代谢产物合成会导致细胞生长的抑制,这一现象的发生伴随着蛋白质含量及pH值之间的变化。细胞在产生次生代谢产物的同时,细胞鲜重显着下降并且随刺激时间的增加下降比率越大。经检测伴随细胞鲜重下降,培养体系pH值也明显下降、细胞内可溶性蛋白质的含量明显增加。因此判断pH值变化和防御蛋白合成可能是造成细胞鲜重下降的主要原因。4、在开展了生物、非生物诱导对欧洲花楸影响的基础上,首次模拟自然界的情况,开展了生物和非生物复合诱导对欧洲花楸悬浮细胞生长和次生代谢产物合成和积累的影响研究。发现了欧洲花楸细胞生长、次生代谢产物合成随环境胁迫强度(浓度)及时间变化规律。虽然重金属不能直接诱导联苯类物质产生,但是重金属可以通过其它机制调控次生代谢产物的合成。在研究YE和叁种重金属复合诱导时,发现镧和铜元素能够增加YE诱导下细胞的鲜重,铅元素使得YE诱导下细胞鲜重进一步降低,表明镧、铜对YE胁迫有拮抗作用,而铅对YE胁迫有协同作用。叁种元素的起效时间均与浓度相关,低浓度诱导下,起效时间在96-132h,中间浓度在48-72h,高浓度在12-24h。镧元素不影响YE诱导次生代谢产物合成的趋势,但是镧元素可以提高次生代谢产物合成量,在镧浓度是1μg/L时,显着(与YE相比,p<0.05)提高了eriobofuran的合成量,镧浓度是10mg/L时,诱导noraupuparin明显增加。铜元素可以使YE诱导次生代谢产物合成峰值的时间提前,在铜浓度为0.5mg/L时,使aucuparin合成峰值从132h提到72h。次生代谢产物合成量与铜浓度相关,随着铜浓度增加,次生代谢产物合成量逐渐减少。对于noraupuparin,在0.5mg/L诱导下合成量是50mg/L诱导下的6.5倍。铅元素对YE诱导次生代谢产物合成与浓度相关,浓度为0.05mg/L、0.1mg/L时,化合物合成的量的趋势是下降,浓度为5mg/L、100mg/L时,化合物合成的量的趋势是上升,浓度为0.5mg/L时,化合物合成量的最低。
周东[8]2014年在《茉莉酸甲酯和水杨酸对菊芋悬浮细胞菊糖含量的影响》文中认为菊芋(Helianthus tuberosus L.)是一种向日葵属多年生草本植物,它具有较强的抗逆性,能在干旱、盐碱、严寒等恶劣环境下生长,在国内外被广泛种植。菊芋块茎中富含菊糖,菊糖是一种多聚果糖,有多种生理功能,目前被广泛应用到药业及食品工业中。利用悬浮细胞培养提高植物次生代谢产物的产量,是生产某些代谢产物的新方法。本试验以菊芋块茎为材料,诱导出块茎的愈伤组织,进而建立了菊芋块茎悬浮细胞系,并对悬浮细胞培养条件进行了优化。以茉莉酸甲酯和水杨酸为诱导子,研究其对菊芋悬浮细胞菊糖含量的影响,为利用细胞悬浮培养进行菊糖工业化生产提供了理论依据。本试验研究结果如下：(1)本研究首先诱导出菊芋块茎愈伤组织,用MS+NAA1.Omg/L+6-BA1.0mg/L培养基可诱导出淡黄色,疏松均一的愈伤组织。(2)利用诱导出的愈伤组织,转接到MS+NAA1.Omg/L+6-BA1.0mg/L液体培养基中,建立了菊芋悬浮细胞系,在pH为5.8-6.0,蔗糖浓度为30g/L,脯氨酸0.5mg/L、谷氨酰胺1mg/L的生长条件下,细胞生长状态最好。进一步建立了悬浮细胞系生长曲线、pH变化曲线,得知细胞在第6天进入对数生长期,在18天生长量最大。(3)建立了高效液相色谱测定悬浮细胞菊糖含量的方法,采用蒸发光检测器,以乙腈和水为流动相(乙腈：水=78：22),流速1mL/min,柱温30℃C,进样时间为20min。(4)通过添加不同浓度的茉莉酸甲酯,确定了100μmol/L的茉莉酸甲酯为最佳浓度,可诱导细胞干重达到最大,为7.908mg/mL,诱导菊糖含量达到最高,为21.3%,菊糖产量与对照相比提高了71.13%；同时通过不同时间添加茉莉酸甲酯,确定了在第6天,即细胞即将进入对数生长期时添加茉莉酸甲酯,细胞干重达到最大,为7.888mg/mL,菊糖含量最高,为21.5%,菊糖产量与对照相比提高了72.35%。(5)通过添加不同浓度的水杨酸,确定了60μmol/L的水杨酸为最佳浓度,可诱导细胞干重达到最大,为7.73mg/mL,诱导菊糖含量达到最高,为17.3%,菊糖产量与对照相比提高了35.77%；同时通过不同时间添加水杨酸,确定了在第6天,即细胞即将进入对数生长期时添加水杨酸,细胞干重达到最大,为7.724mg/mL,菊糖含量最高,为17.42%,菊糖产量与对照相比提高了36.74%。
王渭玲[9]2008年在《膜荚黄芪营养特性及次生代谢调控的研究》文中研究表明膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch．)为豆科紫云英属多年生草本植物，以根入药，为传统的大宗药材。随着对黄芪药理作用及保健作用认识的不断深入，黄芪除供药用外，还广泛用于饮料、补品、化妆品、茶等工业生产中，市场需求用量逐年增加。人工栽培黄芪已成为主要的药材来源途径，但由于对黄芪矿质营养理论方面缺乏研究，黄芪的施肥技术尚无系统的资料，导致栽培黄芪的产量和质量偏低，严重制约了黄芪产业的发展。本论文采用田间试验和毛状根培养试验，系统研究了膜荚黄芪矿质营养特性、优化施肥模式、不同营养元素条件下黄芪多糖及黄芪皂苷的积累动态变化、毛状根培养系统的建立及毛状根的生长及次生代谢的调控。这些研究结果不仅具有重要的科学意义，也将为黄芪高产优质人工栽培技术的建立、对保护野生黄芪资源、对减轻生态环境破坏、实现中药现代化和中药国际化具有重要意义。主要研究结果如下：1．膜荚黄芪干物质累积规律通过对黄芪干物质累积动态分析，得出黄芪干物质累积的Logistic方程为：W_1=(33170)/((1+298126e)~(-0.1087x))，R~2=-0．9939~(**)，相关性达到极显着水平，因此可用此模型计算黄芪生长期间的干物质积累量。黄芪植株不同部位干物质累积与分配随生长季节而变化，出苗后100～132d是地上部分干物质积累最快的时期，占总积累量的88．22％；根系干物质累积晚于地上部分，出现在出苗后163d～185d。全株干物质的累积率在出苗后100～132d，快速增加，是植株干物质累积最快的时期，主要是茎叶干物质组分。出苗后132～163d，全株干物质累积量最多，主要是根部干物质组分。2．黄芪植株N、P、K、Fe、Mn、Zn、Cu的吸收、分配特性与最大效率期黄芪植株对NPK的吸收量为N＞K＞P。不同部位的含量为茎叶＞根系。N、P、K含量苗期最高，随生育进程而下降。不同生育时期黄芪的养分积累状况是不均衡的，整株养分的积累量前期少，中期增加迅速，后期缓慢增加。地上N、P、K的积累量从苗期持续增加到出苗后163d左右达到高峰后，随后积累量增加缓慢。根系中N、P、K的积累量一直呈上升趋势，到收获期达到最大值。各个生育时期的地上部分和根系中，N的积累量最大，K次之，P最小。临界期和最大效率期以养分相对积累速率(RARN，g·g~(-1)·d~(-1))分析养分累积高峰期，N、P的最大相对积累强度在100d左右，K的最大相对强度在100～132d之间。出苗后70～100d是N、P、K营养临界期；出苗后100～132d，N、P、K相对吸收强度基本都维持在最高值，是黄芪N、P、K养分最大效率期。黄芪植株Fe、Zn、Cu、和Mn的吸收与累积特性为：Fe、Mn、Zn、Cu元素的含量呈前期逐渐增加后期逐渐下降的趋势。黄芪根系中元素含量为Fe＞Zn＞Cu＞Mn。植株中元素的累积量均为Fe＞Zn＞Mn＞Cu。3．N、P、K对黄芪生长及次生代谢物累积的影响与优化施肥模式研究黄芪的生长及产量形成因子明显受N、P、K肥的供应水平所影响，影响程度由大到小依次为NPK配合＞单施N＞单施K＞单施P。N、P、K各元素及其配比明显影响了黄芪多糖、黄酮和总皂苷的累积，P、K促进了黄芪多糖、黄酮的累积，N、K促进了总皂苷的累积。对黄芪的需肥特性研究表明，黄芪根系中不同元素吸收积累总量顺序为：N＞K＞P＞Fe＞Zn＞Mn＞Cu。每生产100kg黄芪药材需要从土壤和肥料中吸收2．32kgN；0．323kg P_2O_5；1．62kg K_2O；37．77gFe；2．24g Zn；0．66g Mn；0．65gCu。N：P_2O_5：K_2O为7．18：1：5．02。建立了黄芪产量、黄芪根总皂苷与N、P、K叁因素的回归模型，采用频率分析法对模型寻优，目标产量为6300～7300 kg／hm~2及目标总皂苷含量为12．0～13．5mg／g时，优化施肥方案为N138～156Kg／hm~2，P_2O_579～85 Kg／hm~2，K_2O122～43Kg／hm~2，配比为1：0．5：0．87。4．黄芪毛状根培养体系的建立及次生代谢的调控用发根农杆菌R1601感染，以下胚轴作为的外植体，菌液A600 nm为0．55～0．60，侵染时间15min，外植体与发根农杆菌共培养3 d，MS培养基附加NAA 0．5mg／L，IBA0．2mg／L及以羧苄青霉素为除菌剂。黄芪毛状根生长可分为延迟期(0～5 d)、恒速生长期(5～25d)和衰亡期(25～40 d)。培养25d毛状根的生长量到达最大值。恒速生长期中毛状根干重的平均增长速率符合方程：(dx)/(dt)=(3．37g)/(F．d) R~2=0．841~(**)相关性达极显着水平。IAA、IBA及NAA在0．1-0．5mg／L浓度范围时促进毛状根生长；2．4-D浓度时抑制黄芪毛状根生长。IAA和NA A促进黄芪毛状根多糖和总皂苷的累积，IBA和2．4-D对黄芪毛状根多糖和总皂苷的积累有负作用。茉莉酸甲酯和水杨酸对黄芪毛状根生长及多糖和总皂苷累积具有促进作用。
文涛[10]2008年在《虎杖愈伤组织白藜芦醇次生代谢调控体系研究》文中指出虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)为多年生蓼科草本植物,是我国传统中药,其主要活性成分白藜芦醇(Resveratrol)是一种天然抗毒素,同时具有多种药理作用,被誉为最有前途的抗癌药物之一。为了实现该药用植物资源的可持续利用,以获得高含量的白藜芦醇为目标,本研究建立了虎杖愈伤组织无性系。从愈伤组织的光、温培养条件、前体物质苯丙氨酸的添加,以及真菌诱导子、水杨酸与紫外线诱导方面对其展开了系统研究,并通过对诱导培养过程中虎杖愈伤组织生理生化变化的分析,探讨了调控措施对愈伤组织中白藜芦醇生物合成的影响,建立了提高虎杖愈伤组织白藜芦醇含量的调控技术。并得出以下主要结论:1.通过研究外植体和培养基对愈伤组织的影响,了解到以茎段作为外植体,其愈伤组织生长比叶片快,且其中的白藜芦醇含量为叶片中的5倍;MS培养基上的愈伤组织增殖量最多,其茎段和叶片的鲜重增长率均极显着高于N6和B5培养基,分别达到了141.0%和73.8%,但鲜样中白藜芦醇含量略低于B5培养基。因此,以MS为基本培养基,茎段为外植体诱导出的愈伤组织成愈较高,生长旺盛,维持时间长,白藜芦醇含量高,优于其他处理。2.通过分析愈伤组织生长与白藜芦醇含量的关系,可见在愈伤组织生长最快时期,白藜芦醇含量增加也达到最高,因此对于虎杖愈伤组织的收获应选择在愈伤组织快速生长达到饱和时的时期,整个培养可在同一种培养基中完成。3.通过正交实验研究了溶剂种类、时间、温度对愈伤组织中白藜芦醇提取率的影响,极差分析结果显示,提取工艺过程中最重要的因素为提取温度,其次是提取时间,而提取溶剂对白藜芦醇提取率的影响最小。综合评价各指标,用乙酸乙酯在4℃下提取48 h效果最佳。4.将茎段诱导出的愈伤组织,分别置于暗光(0 lx)、弱光(1340～1560 lx)、强光(3110～3310 lx)叁个条件下进行培养,结果显示,愈伤组织的生物量随着光照强度的增强而增加,强光培养下愈伤组织的生物量达到了53.682 g/LFW。但白藜芦醇含量与光照强度不成正相关,弱光培养下,愈伤组织中白藜芦醇的含量显着高于另外两个处理,为140.074μg/gDW。因此虎杖愈伤组织对光敏感,以弱光培养效果最好。25℃培养条件下茎段愈伤组织生长速度适宜,愈伤组织出现较早,愈伤组织中白藜芦醇含量最高。5.通过不同浓度前体物质苯丙氨酸饲喂虎杖愈伤组织,研究发现10～30 mg/L浓度的苯丙氨酸能促进愈伤组织生物量的增殖,20 mg/L处理愈伤组织生物量增殖最多。用Richards方程模拟愈伤组织的生物量在一个生长周期内的动态积累过程,可以稳健、可靠地估计不加前体物质愈伤组织的生长动态变化,发现苯丙氨酸在一定程度上调节了愈伤组织的增长情况。由生长速率参数(K)可知,随着苯丙氨酸浓度的增加,愈伤组织增长速度加快,极显着高于对照16.5倍以上。且白藜芦醇含量也随着苯丙氨酸浓度的增加而增加,30mg/L处理白藜芦醇的含量达到最大值,鲜样、干样中分别为18.025μg/g和241.489μg/g,较对照高出16.8%和5.7%。6.前体物质苯丙氨酸能诱导苯丙氨酸裂解酶(PAL)活性的增高,PAL的活性表现出随着添加的苯丙氨酸浓度的增大而升高。各处理PAL活性的变化趋势基本一致,都在培养的第7d达到最大值,表明培养前期,苯丙氨酸浓度的增加促进了PAL活性的增强,为白藜芦醇的合成提供了充足的底物,促进了白藜芦醇的合成。此外添加适量的前体物质能延缓虎杖愈伤组织细胞的衰老,增强愈伤组织的抗性。7.通过以黑曲霉、青霉、啤酒酵母和灰葡萄孢的粗提物为诱导子对愈伤组织进行诱导,发现黑曲霉诱导子对白藜芦醇合成的促进作用最为显着,比对照提高了50.2%,表明虎杖对真菌诱导子种类具有选择性。同时研究发现以100 mg/L的黑曲霉诱导子效果最好,比对照高128.9%。同时,诱导子添加时间不同对愈伤组织和白藜芦醇含量的影响不同,以第0d加入白藜芦醇含量最高,但对愈伤组织生物量的积累有抑制作用,而在第14d和21d加入诱导子对愈伤组织生物量的积累没有影响。在诱导培养过程中,分析白藜芦醇含量的变化规律发现,培养到第6天白藜芦醇含量达到最高,为227μg/g,而在第6天后白藜芦醇含量开始下降。综合分析可得到虎杖愈伤组织真菌诱导优化方案:在接种后第14d加入100mg/L的黑曲霉诱导子,诱导培养6d后收获,可以使处理中白藜芦醇的含量比对照提高2.25倍。8.对黑曲霉诱导子组分分离研究结果表明,黑曲霉诱导子提取液中主要是真菌壁多糖诱导了愈伤组织中白藜芦醇的生物合成,而蛋白质对愈伤组织中白藜芦醇的合成有抑制作用。9.通过分析真菌诱导子对虎杖愈伤组织中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)酶活性的影响、内源激素脱落酸(ABA)的变化以及POD和CAT同工酶变化,研究发现真菌诱导子刺激后在培养第1d到第4d内源ABA含量大量产生,呈急剧上升趋势,在第4d达到峰值,PAL活性迅速增加,也在第4d达到最高;同时在培养的前3d,SOD和POD酶活性下降,CAT在第2d出现第一次高峰:当培养到第5d至第6d,对照与诱导处理之间出现很大的差异,SOD与POD活性诱导处理突然出现下降再急剧上升的趋势,而对照则维持较高水平;CAT在第5天出现第二次高峰;POD同工酶有新酶带的出现。10.通过对水杨酸添加浓度、加入时间、诱导时间的筛选,发现在接种后第14d加入7mg/L的水杨酸,诱导6d的效果最好,可以使白藜芦醇比对照高近1倍,但诱导效果不及黑曲霉诱导子。黑曲霉诱导子与水杨酸、苯丙氨酸的进行不同组合,研究发现各组合对白藜芦醇的合成均有一定促进作用但与单独添加黑曲霉诱导子相比变化不大,黑曲霉诱导子、水杨酸和苯丙氨酸叁种物质组合效果最好。11.紫外光(30W)下20cm处照射,每次照射15 min,停止5 min,重复照射6次,2h照射时间处理,不能提高愈伤组织中自藜芦醇含量。12.建立了提高虎杖中白藜芦醇含量的调控技术,以虎杖茎段为外植体,在MS+6-BA 1.0+KT 0.2～0.5+NAA 0.2(mg/L)培养基上建立愈伤无性系,转接于液体培养基上,在继代后第14天加入黑曲霉粗提物100 mg/L为诱导子。同时饲喂20mg/L苯丙氨酸和微量水杨酸,在弱光1300lx,25℃培养,加入后第6天收获,可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量达3倍以上。
参考文献：
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[9]. 膜荚黄芪营养特性及次生代谢调控的研究[D]. 王渭玲. 西北农林科技大学. 2008
[10]. 虎杖愈伤组织白藜芦醇次生代谢调控体系研究[D]. 文涛. 四川农业大学. 2008
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