增强UV-B辐射对拟南芥染色质组装因子FAS1的影响

增强UV-B辐射对拟南芥染色质组装因子FAS1的影响

论文摘要

自20世纪以来,随着人类工业化进程的不断推进,排放到空气中的氯氟烃等氮氧化物增加,导致了地球表面臭氧层不断变薄以至出现了空洞情况,使得到达地面的太阳光中的紫外线B(UV-B)也随着增强。增强UV-B会对地球表面的动植物的生理生长产生严重影响,如诱导小麦产生异常分裂。染色质组装因子FAS1与组蛋白H3和H4的功能有关,影响DNA的合成,参与细胞有丝分裂过程。本研究以染色质组装因子FAS1为切入点,研究其参与响应UV-B辐射产生的异常有丝分裂的分子机制,为研究植物响应UV-B辐射提供理论依据。本研究以野生型和fas1突变体拟南芥为材料,构建pSuper1300:FAS1-GFP过表达载体和pFAS1::FAS1-GFP自身启动子表达载体,分别对过表达株系、恢复表达株系和T-DNA插入突变体纯合株系进行鉴定,观察UV-B辐射后不同植株的形态特征,测定生理生化指标变化,并在激光共聚焦下观察FAS1与染色体的定位,初步分析FAS1响应UV-B辐射产生的异常有丝分裂的可能机制,主要结果如下:(1)构建pSuper1300:FAS1-GFP过表达载体,pFAS1::FAS1-GFP自身启动子载体。利用农杆菌GV3101感染法,将pSuper1300:FAS1-GFP过表达载体重组质粒导入烟草表皮细胞,在激光共聚焦显微镜下观察含有GFP标签的融合蛋白在烟草叶片中的瞬时表达,证明载体构建成功,并确定FAS1与染色体共定位于细胞核和细胞质中。(2)使用“三引物”法,鉴定获得FAS1基因T-DNA插入纯合突变体。(3)过表达载体和自身启动子载体用浸花法分别转化野生型拟南芥植株和纯合突变体拟南芥植株,分别用潮霉素筛选得到纯合转基因植株,并从DNA水平和RNA水平鉴定阳性转基因植株,成功筛选得到过表达拟南芥植株和恢复表达拟南芥植株。(4)对比野生型拟南芥与突变体拟南芥,发现7天的突变体的根长和野生型的根长未表现出显著性差异。突变体拟南芥比野生型拟南芥提前从营养生长阶段过渡到生殖生长阶段,两种植株的成熟果荚和株高存在显著性差异。(5)对比野生型拟南芥植株与过表达拟南芥植株,发现7天植株的根长没有显著性差异。其中成熟果荚的长度和株高,转基因植株都明显高于野生型植株,且差异显著。(6)为了研究UV-B辐射对植株的影响,实验设计分为四个处理组,WT植株、pSuper1300:FAS1-GFP过表达植株、fas1突变体植株、pFAS1::FAS1-GFP恢复表达植株分别在正常光照和UV-B辐射的条件下培养,对根长、株高、可溶性糖、可溶性蛋白、MDA含量进行检测。结果表明,fas1突变体拟南芥根长、株高、可溶性糖、可溶性蛋白、MDA的含量都对UV-B辐射最敏感,WT植株和pFAS1::FAS1-GFP恢复表达植株组程度相似,pSuper1300:FAS1-GFP过表达植株对UV-B辐射最不敏感。(7)为了研究UV-B辐射处理时FAS1与染色体之间的相关性,实验中用DAPI标记拟南芥根尖染色体,使用激光共聚焦显微镜观察染色体与细胞分裂期,FAS1集中分布在细胞核中;当增强UV-B辐射的情况下,GFP荧光强度减弱,没有观察到明显的异常分裂的现象。染色质组装因子是一种高度保守的异源三聚体复合物,在动植物的生长发育的过程中扮演着十分重要的角色。染色质组装因子能够保证细胞中异染色质的稳定性,使其中的相关基因保持沉默。通过研究增强UV-B辐射,野生型植株、fas1突变体植株以及转基因植株的根尖细胞有丝分裂过程中染色体和FAS1的动态变化,来为揭示“分束分裂”现象的分子机制提供进一步的理论基础。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 1 引言
  •   1.1 研究背景
  •     1.1.1 UV-B辐射研究进展
  •     1.1.2 UV-B辐射对植物形态和生长的影响
  •     1.1.3 增强UV-B辐射对植物在生理生化代谢水平上的影响
  •     1.1.4 植物响应UV-B辐射的信号通路
  •     1.1.5 染色质组装因子1(CAF-1)的研究进展
  •   1.2 研究目的与意义
  •   1.3 研究内容
  • 2 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 实验材料
  •     2.1.2 实验试剂
  •     2.1.3 实验仪器
  •     2.1.4 实验溶液的配制
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 材料培养
  •     2.2.2 表达载体的构建
  •     2.2.3 重组质粒的转化及鉴定
  •     2.2.4 重组质粒瞬时表达
  •     2.2.5 浸花法转化拟南芥
  •     2.2.6 筛选阳性转基因植株
  •     2.2.7 T-DNA插入突变体的纯合性鉴定
  •     2.2.8 UV-B辐射处理的条件及方法
  •     2.2.9 生理生化指标的检测
  •     2.2.10 图像采集
  •     2.2.11 数据分析
  • 3 结果与分析
  •   3.1 过表达载体的构建
  •     3.1.1 RNA的提取和反转录
  •     3.1.2 FAS1 基因的扩增
  •     3.1.3 FAS1 基因的纯化
  •   3.2 PCR验证和酶切验证
  •   3.3 过表达载体质粒测序结果比对
  •   3.4 自身启动子载体的构建
  •     3.4.1 pFAS1 基因的扩增
  •     3.4.2 pFAS1 基因的纯化
  •   3.5 PCR验证和酶切验证
  •   3.6 自身启动子质粒测序结果比对
  •   3.7 过表达载体的瞬时表达
  •     3.7.1 烟草叶片表皮细胞中的瞬时表达
  •     3.7.2 原生质体中的瞬时表达
  •   3.8 DNA水平鉴定阳性转基因植株
  •   3.9 FAS1 在拟南芥根尖中的表达
  •   3.10 T-DNA插入突变体的鉴定
  •   3.11 拟南芥野生型植株与突变体植株的表型比较
  •   3.12 拟南芥野生型植株与转基因植株的表型比较
  •   3.13 增强UV-B辐射对拟南芥的影响
  •     3.13.1 增强UV-B辐射对拟南芥根长的影响
  •     3.13.2 增强UV-B辐射对拟南芥生理指标的影响
  •     3.13.3 增强UV-B辐射对拟南芥有丝分裂的影响
  • 4 讨论
  •   4.1 增强UV-B辐射对拟南芥根长的影响
  •   4.2 FAS1 功能的缺失对拟南芥生理生化指标的影响
  •   4.3 FAS1 功能的缺失对拟南芥有丝分裂的影响
  •   4.4 待解决的问题
  • 5 结论
  • 参考文献
  • 在学期间研究成果
  • 致谢
  • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 李婷

    导师: 韩榕

    关键词: 拟南芥

    来源: 山西师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 山西师范大学

    基金: 国家自然科学基金(30671061),山西省自然科学基金(2014011028-5),山西师范大学研究生创新项目(2017SCX041)

    分类号: Q943.2

    DOI: 10.27287/d.cnki.gsxsu.2019.000471

    总页数: 82

    文件大小: 5489K

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