猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12抑制I型干扰素表达作用机理的研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是一种易于发生变异和重组的RNA病毒,PRRSV感染后可造成持续性感染和免疫抑制,对养猪业危害极为严重。天然免疫反应是宿主抗病毒感染的重要方式,PRRSV能够利用其编码蛋白拮抗宿主天然免疫应答,逃避宿主免疫监测。Nsp12是PRRSV复制相关的非结构蛋白,其是否参与拮抗宿主天然免疫反应尚未解析,本研究重点围绕HP-PRRSV HuN4株Nsp12在抑制I型IFN信号通路中的作用机理展开研究。在实验室前期研究发现HuN4株Nsp12能够抑制IFN-I表达的基础上,为了探究Nsp12抑制IFN-I表达的分子途径,本研究利用双荧光素酶报告系统、荧光定量PCR等分析了HuN4株Nsp12对IFN-β转录启动活性的影响,结果显示,HuN4株Nsp12能够抑制IFN-β的转录和启动子活性,而且这种抑制作用呈明显的剂量依赖性。HP-PRRSV与经典毒株Nsp12存在4个氨基酸差异,但这些差异氨基酸均不影响Nsp12抑制IFN-β启动子的活性。将Nsp12经过系列截短后分析其抑制IFN-I表达的主要功能域,结果显示Nsp12抑制IFN-I表达的主要区域位于其N端结构域。为了确定Nsp12抑制IFN-β的信号通路,我们检测了Nsp12对RIG-I信号通路和TLR3通路的影响,结果显示,Nsp12对RIG-I及其接头蛋白MAVS诱导的IFN-β产生了明显的抑制作用,但对TRIF刺激的IFN-β产生没有抑制作用,表明Nsp12是通过RIG-I信号通路抑制IFN-β表达,而非TLR3信号通路。由于IFN-β的表达可受转录因子IRF3和NF-κB的调节,我们检测了Nsp12对IRF3和NF-κB结合域的启动子活性,结果显示,Nsp12能够抑制转录因子NF-κB结合域的启动子活性。而且Nsp12还可以抑制由TNF-α刺激引起的p65蛋白核迁移。以上研究结果证实HP-PRRSV HuN4株Nsp12能够通过NF-κB的激活途径抑制IFN-β的表达。为了继续探究Nsp12蛋白的功能,我们将前期通过酵母双杂交筛选出的与Nsp12互作的宿主细胞蛋白半乳糖凝集素3（LGALS3）,利用免疫共沉淀和激光共聚焦试验进行鉴定,结果证实Nsp12和LGALS3存在相互作用,并确定了LGALS3与Nsp12相互作用的区域位于LGALS3（125aa-166aa）。将LGALS3过表达后,可使HuN4株在Marc-145细胞中的增殖受到明显抑制,而在LGALS3缺失细胞系Marc-145ΔLGALS3中则可促进HuN4株的增殖。有趣的是,我们发现在Marc-145细胞中LGALS3过表达不仅能够抑制IFN-β的启动子活性,而且可以抑制RIG-I诱导的IFN-β产生,同时还能够抑制转录因子NF-κB结合域的启动子活性。在Marc-145ΔLGALS3缺失细胞系中,由poly（I:C）刺激诱导的IFN-β启动子活性明显强于正常的Marc-145细胞;Nsp12虽然在两种细胞系中均能抑制IFN-β启动子的活性,但其在Marc-145ΔLGALS3缺失细胞系中的抑制程度明显弱于正常Marc-145细胞。上述研究表明,互作蛋白LGALS3可能在Nsp12抑制IFN-β表达的过程中发挥了协同作用,但Nsp12抑制IFN-β表达并非完全依赖于互作蛋白LGALS3。综上所述,本研究证实了PRRSV Nsp12能够通过RIG-I/NF-κB通路抑制IFN-I的表达,其互作蛋白LGALS3也能够协助Nsp12通过RIG-I/NF-κB通路发挥抑制作用,为阐明PRRSV免疫抑制机理提供了新的理论依据。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李先斌

导师: 周艳君

关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒,半乳糖凝集素,型干扰素

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

分类号: S852.651

总页数: 56

文件大小: 4476K

下载量: 163

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标签：猪繁殖与呼吸综合征病毒论文;  半乳糖凝集素论文;  型干扰素论文;