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粪肠球菌对小鼠血脑屏障通透性及脑组织损伤相关因素的研究

2020-12-02阅读(866)

粪肠球菌对小鼠血脑屏障通透性及脑组织损伤相关因素的研究

论文摘要

粪肠球菌是人和动物体内正常菌群的重要组成部分,随着抗生素的持续大量使用,粪肠球菌的耐药性普遍提高,是一种重要的条件致病菌,能引起人和动物感染性疾病的发生,威胁着人类健康和畜牧业的健康发展。如今,粪肠球菌感染动物造成脑膜炎的病例逐年增多,而粪肠球菌是如何穿越对多种物质具有选择透过性的血脑屏障而进入脑部,并对脑组织造成损伤的机制却鲜有报道。因此,本研究在前期工作基础上,选择从患有脑膜炎的羔羊脑组织中分离到的2株粪肠球菌XJ3、XJ8为研究对象,探究其对小鼠血脑屏障造成的损伤,并查明小鼠脑组织损伤程度与氧化应激反应相关指标SOD、MDA以及p38MAPK信号通路的相关性,为今后的研究提供参考。目的:（1）建立2株粪肠球菌感染小鼠脑部模型并评估。（2）检测小鼠血脑屏障相关指标AQP4、GFAP、MMP-2和Claudin-5的表达量情况,分析2株粪肠球菌对血脑屏障造成的损伤程度。（3）研究2株粪肠球菌对小鼠脑部氧化应激反应相关指标SOD、MDA的变化,判断粪肠球菌对脑组织的损伤作用。（4）探究致羔羊脑膜炎粪肠球菌与小鼠脑内p38MAPK信号通路的相关性,为研究粪肠球菌穿越血脑屏障的感染机制奠定基础。方法:（1）用寇氏法计算半数致死量（LD50）,以2/3 LD50剂量感染小鼠,观察小鼠状况,并在取样前2h尾部注射伊文思蓝,设2 h、8 h、12 h、24 h、36h、48h、60h、72 h为取样时间,取样后制作冰冻切片,于激光共聚焦显微镜下观察脑组织中伊文思蓝的分布情况。（2）试验将50只雌雄对半的小鼠随机分为XJ3号菌株组（22只）、XJ8号菌株组（22只）和对照组（6只）,采用各菌株的2/3 LD50剂量建立小鼠脑部损伤的模型,分别于2 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72h这8个时间点进行取样,运用qRT-PCR和免疫组化的方法检测AQP4、GFAP、MMP-2和Claudin-5的基因水平及蛋白水平表达量的变化。（3）试验以各菌株的2/3 LD50剂量建立感染小鼠脑部损伤模型,并在相应时间点采集小鼠心脏血液分离血清样品,采用ELISA方法检测2株菌株感染小鼠后其血清中SOD的活性及MDA含量的变化情况。（4）试验以各菌株的2/3 LD50为感染剂量建立小鼠脑部损伤模型,在相应时间点取样,利用Western Blot的方法检测2株菌株感染小鼠后其脑组织中磷酸化p38MAPK表达量的变化的情况。结果:（1）XJ3LD50=3.12×109CUF,XJ8LD50=2.53×1010CUF,以2/3LD50感染小鼠后其死亡率分别为24.0%和8.0%;2株粪肠球菌均可使小鼠血脑屏障开放,脑组织中EB的进入量均高于空白对照组,且时间变化趋势相同,均在24 h和48 h出现高峰,2株菌株各组内与对照组比较、2株菌株组各时间点进行两两比较差异显著（P<0.05）。（2）2株菌株分别感染小鼠后,AQP4、GFAP、MMP-2的表达量均高于对照组,且于24h达到最大值,48 h有较高的表达量;Claudin-5的表达量均低于对照组,于24h表达量最低,48 h表达量稍低;2株菌株各组内比较、组间比较均有差异显著性（P<0.05）。（3）2株菌株分别感染小鼠后,各组内时间点与空白组相比其血清中SOD的活性降低明显、MDA的含量升高明显,差异有统计学意义（P<0.05）,同时均于24h变化明显,48h变化较为明显;2菌株组组间各时间点进行两两比较,发现XJ3号菌株SOD、MDA变化量均高于XJ8号菌株的变化量。（4）2株菌株感染小鼠后,p38MAPK信号通路均被激活为p-p38的形式,通过检测p-p38的蛋白表达量,发现对照组的p-p38没有表达,试验组小鼠感染粪肠球菌后的蛋白表达量均高于对照组,有显著差异性（P<0.05）,且于24 h达到峰值,48 h有较高的表达量;同样,2株菌株组间两两比较时有显著差异性（P<0.05）。结论:（1）利用伊文思蓝的荧光可直观的观察血脑屏障的开放状况,说明2株菌株以各自的2/3 LD50剂量感染小鼠模型建立成功。（2）2株粪肠球菌均能对小鼠血脑屏障的结构及功能造成破坏,使其结构受损,通透性增加。（3）具有不同致病性、含有不同毒力因子的粪肠球菌均能造成脑内氧化应激反应,进而加重血脑屏障的损伤。（4）粪肠球菌能透过血脑屏障进入脑组织对其造成影响,与p38 MAPK信号通路的激活有着直接的联系。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 英文缩略词对照表
  • 第一章 绪论
  •   1 粪肠球菌研究进展
  •     1.1 粪肠球菌生物学特性
  •     1.2 粪肠球菌的致病性
  •       1.2.1 粪肠球菌对人的致病性
  •       1.2.2 粪肠球菌引起动物的疾病
  •     1.3 粪肠球菌的致病机制
  •   2 血脑屏障的研究进展
  •     2.1 血脑屏障的概念
  •     2.2 血脑屏障的结及构功能
  •     2.3 影响血脑屏障通透性和脑组织损伤的因素
  •       2.3.1 Claudin-5 对血脑屏障通透性的影响
  •       2.3.2 MMP-2 对血脑屏障通透性的影响
  •       2.3.3 AQP4 对血脑屏障通透性的影响
  •       2.3.4 GFAP对血脑屏障通透性的影响
  •       2.3.5 SOD和 MDA对血脑屏障通透性及脑组织损伤的影响
  •   3 p38MAPK信号通路与脑损伤的相关性
  • 第二章 试验内容
  •   试验一 2株粪肠球菌穿越小鼠血脑屏障感染模型的构建及评估
  •     1 材料
  •       1.1 主要试剂
  •       1.2 主要仪器
  •       1.3 菌株来源
  •       1.4 实验动物
  •     2 方法
  •       2.1 粪肠球菌感染模型的建立
  •     2.1.1 菌液的平板计数
  • 0和LD100 的测定'>    2.1.2 2 株粪肠球菌LD0和LD100的测定
  • 50 的确定'>    2.1.3 2 株粪肠球菌LD50的确定
  •     2.1.4 小鼠感染模型的建立
  •     2.1.5 细菌的回收鉴定
  •     2.1.6 粪肠球菌16S rRNA的检测
  •       2.2 利用EB检测血脑屏障开放状况
  •     2.2.1 伊文思蓝染色
  •     2.2.2 冰冻切片制作
  •       2.3 统计分析
  •     3 结果
  •       3.1 2 株粪肠球菌感染模型的建立
  • 50 的测定'>    3.1.1 2株粪肠球菌LD50的测定
  • 50 的计算'>    3.1.2 两株菌株LD50的计算
  •     3.1.3 细菌分离培养及涂片染色镜检结果
  •     3.1.4 特异性片段扩增
  •     3.1.5 感染小鼠临床症状的观察
  •       3.2 EB检测小鼠血脑屏障开放情况结果
  •     4 讨论
  •     5 小结
  •   试验二 对小鼠血脑屏障通透性主要结构相关指标AQP4、GFAP、MMP-2和Claudin-5 的分析
  •     1 材料
  •       1.1 主要试剂
  •       1.2 试验仪器
  •       1.3 试验动物
  •       1.4 试验菌株
  •     2 方法
  •       2.1 动物模型的制备及样品的采集
  •       2.2 qRT-PCR检测AQP4、GFAP、MMP-2和Claudin-5 基因表达量
  •     2.2.1 脑组织总RNA的提取
  •     2.2.2 反转录
  •     2.2.3 目的基因引物的合成
  •     2.2.4 qRT-PCR反应体系及扩增程序
  •     2.2.5 实时荧光定量PCR结果分析
  •       2.3 免疫组织化学测定MMP-2、Claudin-5、AQP4和GFAP的表达
  •       2.4 统计分析
  •     3 结果
  •       3.1 动物模型制备结果
  •       3.2 脑组织中MMP-2、Claudin-5、AQP4和GFAP基因水平变化
  •       3.3 脑组织中MMP-2、Claudin-5、AQP4和GFAP蛋白表达变化
  •     3.3.1 AQP4 表达的免疫组化的动态观察
  •     3.3.3 小鼠脑组织中GFAP免疫组化染色结果
  •     3.3.4 Claudin-5 蛋白的表达
  •     3.3.4 MMP-2 蛋白的表达
  •     4 讨论
  •     5 小结
  •   试验三 对小鼠脑损伤中氧化应激反应相关指标SOD、MDA的检测
  •     1 材料
  •       1.1 主要试剂
  •       1.2 试验仪器
  •       1.3 菌株来源
  •       1.4 实验动物
  •     2 方法
  •       2.1 两菌株感染小鼠模型的制备
  •       2.2 小鼠血清中SOD和 MDA的测定
  •       2.3 统计分析
  •     3 结果
  •       3.1 小鼠脑部损伤模型的构建
  •       3.2 小鼠血清中MDA和 SOD的测定
  •     4 讨论
  •     5 小结
  •   试验四 对参与小鼠血脑屏障损伤机制p38MAPK信号通路的探究
  •     1 材料
  •       1.1 主要试剂
  •       1.2 试验仪器
  •       1.3 菌株来源
  •       1.4 实验动物
  •     2 方法
  •       2.1 两株菌株感染小鼠模型的制备
  •       2.2 Western-blot检测p-p38、p38 蛋白的表达量
  •     2.2.1 脑组织蛋白的提取
  •     2.2.2 Western-blot法检测p-p38、p38 蛋白表达量
  •       2.3 数据统计
  •     3 结果
  •       3.1 小鼠脑部模型的构建
  •       3.2 考马斯亮蓝染色结果
  •       3.4 p-p38 的蛋白表达变化
  •     4 讨论
  •     5 小结
  • 全文总结
  • 创新点
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历
  • 课题来源
  • 在校期间发表文章
  • 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 李慧

    导师: 齐亚银,张莉

    关键词: 粪肠球菌,动物模型,血脑屏障,通透性,组织损伤

    来源: 石河子大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 石河子大学

    基金: 国家自然科学基金项目编号:31260610

    分类号: S852.611

    总页数: 68

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