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腺嘌呤碱基编辑器靶向范围的拓宽及体内验证

2020-12-08阅读(916)

腺嘌呤碱基编辑器靶向范围的拓宽及体内验证

论文摘要

胞嘧啶的脱氨导致的C·G至T·A转换是遗传突变的主要来源,根据ClinVar database的数据,此类型突变约占人类已知致病点突变的48%。因此如果能将目标A·T碱基对有效转化为G·C,将有可能对这一约占半数的人类遗传突变进行修复治疗,具有非常重大的意义。传统的CRISPR/Cas9技术在进行基因编辑时会引起DNA双链断裂（Double Strand Breaks,DSBs）,其可以在供体模板的存在下诱导同源重组修复（Homology Directed Repair,HDR）,但是效率非常低并且其脱靶切割会造成安全性问题,尤其是在治疗中。单碱基编辑技术通过将胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶与Cas9突变体融合,实现了不需要产生DSBs即可对单个碱基进行编辑的功能,提高了基因编辑的精确性。其中,腺嘌呤碱基编辑器（Adenine Base Editors,ABEs）能够实现A>G的高效转换,在人类基因治疗和细胞治疗上展现了较高的发展潜力。ABEs的靶点受到Cas9蛋白自身原间隔序列临近基序（Protospacer Adjacent Motif,PAM）序列NGG的限制,因此在实际应用中能靶向的范围具有一定的局限性。本课题着眼于克服ABEs的这种局限性,通过将识别不同PAM序列的Cas9变体,SpCas9n-VQR和SaCas9n-KKH,分别与腺苷脱氨酶融合构建了两种新型腺嘌呤碱基编辑器VQR-ABE和SaKKH-ABE,使腺嘌呤碱基编辑器识别的PAM序列增加了NGA和NNNRRT。通过在哺乳动物细胞系中的测试,我们发现VQRABE的编辑窗口为远离PAM端数起3-9位,最高编辑效率可以达到50%左右;SaKKH-ABE的编辑窗口为3-14位,最高效率也达到了50%左右。因此,我们成功地开发了两款拓展PAM的ABE工具,进一步丰富了腺嘌呤碱基编辑器的工具箱。此外,利用VQR-ABE和SaKKH-ABE我们还成功构建了基因修饰小鼠模型,并检测到在小鼠模型中产生的基因突变可以进行种系遗传,并且没有脱靶的产生。综上所述,本课题通过将SpCas9n-VQR和SaCas9n-KKH分别与腺苷脱氨酶融合,实现了在哺乳动物细胞及胚胎内的高效编辑,成功开发出两款拓展PAM的ABE工具,拓宽了腺嘌呤碱基编辑器的靶向空间,为ABE应用于临床基因治疗提供了潜在的新工具。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 前言
  •   1.1 传统基因编辑工具的介绍
  •     1.1.1 传统基因编辑技术的原理
  •     1.1.2 传统基因编辑技术的发展
  •     1.1.3 CRISPR/Cas9 系统的工作原理
  •   1.2 单碱基编辑工具的诞生与发展
  •     1.2.1 嘧啶碱基编辑器BE的开发
  •     1.2.2 BE工具的优化
  •     1.2.3 嘌呤碱基编辑器—ABEs
  •   1.3 单碱基编辑工具的应用
  •     1.3.1 BE工具的应用
  •     1.3.2 ABE工具的应用
  •   1.4 本课题研究的目的和意义
  • 第二章 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 实验相关试剂
  •     2.1.2 实验相关试剂盒
  •     2.1.3 实验相关仪器
  •     2.1.4 实验相关耗材
  •     2.1.5 实验相关质粒
  •     2.1.6 实验相关细胞系
  •     2.1.7 实验相关动物
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 常用实验试剂的配制
  •     2.2.2 质粒构建的基本流程
  •     2.2.3 细胞系的培养
  •     2.2.4 细胞系的转染
  •     2.2.5 流式细胞分选
  •     2.2.6 提取细胞基因组
  •     2.2.7 单碱基编辑小鼠的构建
  •     2.2.8 小鼠基因组鉴定
  •     2.2.9 脱靶效率检测
  •     2.2.10 高通量深度测序
  •     2.2.11 主要软件和数据库的使用
  • 第三章 实验结果与分析
  •   3.1 腺嘌呤碱基编辑器ABE7.10 的工作特性
  •     3.1.1 ABE7.10 在细胞及小鼠胚胎中的测试结果
  •     3.1.2 小结
  •   3.2 构建改变PAM的新型腺嘌呤碱基编辑器
  •     3.2.1 VQR-ABE的载体构建
  •     3.2.2 SaKKH-ABE的载体构建
  •     3.2.3 小结
  •   3.3 新型ABE工具工作特性的检测
  •     3.3.1 293T细胞上的检测结果
  •     3.3.2 Hela细胞上的检测结果
  •     3.3.3 小结
  •   3.4 VQR-ABE与 SaKKH-ABE在小鼠模型中的应用
  •     3.4.1 构建基因修饰小鼠模型
  •     3.4.2 基因修饰小鼠模型的种系遗传
  •     3.4.3 基因修饰小鼠模型的脱靶检测
  •     3.4.4 小结
  • 第四章 总结与讨论
  •   4.1 总结
  •   4.2 讨论和展望
  • 参考文献
  • 附录Ⅰ 靶点及引物序列
  • 附录Ⅱ 缩略词表
  • 附录Ⅲ 硕士期间学术成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 谢玲

    导师: 陈华青,李大力

    关键词: 单碱基编辑,基因修饰小鼠模型

    来源: 华东师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 华东师范大学

    分类号: Q75

    总页数: 103

    文件大小: 9994K

    下载量: 155

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