组氨酸激酶CheA的二聚结构域与催化结构域之间连接的高活性突变体筛选及功能研究

论文摘要

细菌趋化性是细菌趋利避害选择适宜生长环境的一种机制。这一现象是由一个信号转导通路实现的:不同种类的膜蛋白化学受体的细胞外结构域通过与环境中的分子相结合,起到探测信号的作用,并且与细胞内的单一且保守的组氨酸激酶（CheA）的调节结构域（P5）以及一个小的衔接蛋白（CheW）的相互作用,形成了一个稳定的信号复合体,在这个信号复合体中CheA的自磷酸化活性被跨膜的化学受体严格控制。具有可调控的酶活性的CheA处于细菌趋化性信号转导途径的中心位置,起到信号整合,转化和扩增的核心作用。尽管近年来对信号复合体的结构解析取得了突破性进展,但是CheA活性在信号复合体调节内被严格调控的分子机制仍然不清楚。在由二聚结构域（P3）、ATP结合/催化结构域（P4）和P5三个结构域组成的激酶核心中,各个结构域看似行使一项孤立的基本功能,但是在CheA的功能和调控中又是相关联的。我们实验室之前的研究表明这三个结构域之间的连接对激酶的活性和调节起到了重要的作用:如简单的P3-P4连接单突变就能够明显降低激酶的基础自磷酸化活性并导致激酶被激活能力的缺失。本研究根据这一重要发现对该连接展开了更深入的研究,旨在探索该域间连接是否真正具备影响激酶调节的能力。对CheA P3-P4域间连接高活性突变的筛选发现通过改变该连接的氨基酸序列能够使激酶活性明显增加,其中获得的最高激酶活性为野生型CheA激酶活性的46倍。在缺少P5或同时缺失P5和P4-P5连接时,P3-P4连接突变体无法实现提高自磷酸活性。这一结果表明单独的P3-P4域间连接氨基酸序列的改变不足以完成对激酶活性的调控,它对激酶活性的影响需要P5结构域甚至P4-P5连接的配合来实现。通过将高活性的P3-P4连接和之前我们研究组获得的高活性P4-P5连接组合,虽然没有实现更高的激酶活性,但呈现出不同的CheA活性,甚至是低于野生型的抑制状态,表明两个域间连接对激酶活性的影响不是叠加性的,但相互影响、共同影响激酶的催化结构域活性。在实现高基础自磷酸化活性的情况下,这些高活性P3-P4突变体在体内无法行使正常的细菌趋化性;对它们体外生物化学研究显示在受体介导的情况下,P3-P4域间连接突变并不影响天然存在的受体介导的CheA激活途径,但却干扰到了受体介导的激酶活性的抑制途径。因此,导致高激酶活性的CheAP3-P4连接突变通过破坏CheA的抑制通路,打破CheA原有的处于激活和抑制状态之间的平衡,从而使CheA表现出了高基础自磷酸化活性。

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摘要

ABSTRACT

主要符号和缩写名词

1 引言

1.1 趋化性信号转导的分子机制简介

1.2 组氨酸激酶CheA的简介

1.3 甲基化受体简介

1.4 核心信号复合物的简介

1.5 CheA的调控

1.6 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 质粒

2.1.2 细菌菌株

2.1.3 主要酶和化学试剂

2.1.4 主要实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 大肠杆菌组氨酸激酶P3-P4域间连接对激酶活性影响的研究

2.2.1.1 P3-P4域间连接随机突变的分子克隆

2.2.1.2 组氨酸激酶P3-P4域间连接突变体的获取

2.2.1.3 组氨酸激酶P3-P4域间连接突变体的筛选

2.2.1.4 组氨酸激酶P3-P4域间连接高活性突变体的验证

2.2.1.5 组氨酸激酶P3-P4域间连接325位氨基酸残基保守性验证

2.2.1.6 组氨酸激酶P3-P4域间连接326位的突变学研究

2.2.2 组氨酸激酶CheA的表达

2.2.2.1 P3-P4域间连接突变体CheA的分子克隆

2.2.2.2 组氨酸激酶CheA蛋白表菌株的制备

2.2.2.3 组氨酸激酶CheA蛋白的表达与纯化

2.2.3 CheY蛋白的制备

2.2.3.1 CheY蛋白的表达

2.2.3.2 CheY蛋白的纯化

2.2.4 CheW蛋白的制备

2.2.4.1 CheW蛋白的表达

2.2.4.2 CheW蛋白的纯化

2.2.5 含细胞膜的Tsr受体蛋白的制备

2.2.5.1 含受体的Tsr蛋白的大量表达

2.2.5.2 含受体的Tsr蛋白的纯化

2.2.6 ATP酶分析法

2.2.7 受体和CheW存在条件下CheA的体外激活

2.2.8 受体介导的P3-P4突变体的趋化性

2.2.9 体内FRET CheA激酶活性实验

3 结果与分析

3.1 连接突变株的分离方法

3.2 P3-P4域间连接325位氨基酸残基保守性验证

3.3 P3-P4域间连接高活性突变体的分离

3.4 UU2806中CheA-HD突变体的FRET反应

3.5 P3-P4连接突变株的体外活性测定

3.6 P3-P4连接突变株趋化性的测定

3.7 体外受体介导下的组氨酸激酶的激活与抑制

3.8 在缺少P5结构域时P3-P4连接突变对激酶活性的影响

3.9 P3-P4及P4-P5的双突变的研究

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 贺强

导师: 王喜庆

关键词: 细菌趋化性,组氨酸激酶,域间连接,信号传导,激酶活性

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 扬州大学

基金: 国家自然科学基金(资助号31400649和31670792),江苏省自然科学基金(资助号BK20140477),江苏省高校自然科学研究基金(资助号14KJB180026)

分类号: Q78

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.001312

总页数: 55

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组氨酸激酶CheA的二聚结构域与催化结构域之间连接的高活性突变体筛选及功能研究

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