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大豆GmWRI1a基因启动子克隆及其功能分析

2020-12-10阅读(190)

大豆GmWRI1a基因启动子克隆及其功能分析

论文摘要

高等植物的启动子是构成基因表达载体的重要元件,影响外源基因在植物体内的表达。启动子的序列中包含着许多顺式作用元件,在转录水平上能够调控相应下游基因的表达,从而增强植物对外界复杂生长环境的适应能力。对植物启动子的研究,有助于了解基因转录调控表达模式及其调控机制,还可直接应用于植物基因工程中提高或改进外源目的基因的表达。AP2/EREBP转录因子在抗寒、抗旱、耐高温、耐盐等逆境胁迫中有重要作用,而且还可调节植物对激素如乙烯（ETH）和赤霉素（GA3）等的应答反应,在植物抗逆境胁迫中起重要作用。WRINKLED1（WRI1）转录因子,含有2个AP2结构域,属于AP2/EREBP家族一员。WRI1转录因子在调控脂肪酸代谢过程中也起到关键作用,控制着种子中从糖到油合成的碳源流。本课题组前期从大豆中克隆GmWRI1a基因,该基因通过调控大豆脂肪酸合成代谢途径的相关基因BCCP2、FAE1、KAS1、ACP1等和糖酵解代谢途径相关基因Pl-PKβ1、PDHE1α等提高大豆种子含油量,此外该基因还参与了大豆抗旱和耐盐碱胁迫反应。而通过对该基因启动子的研究,能够进一步鉴定该基因的功能。所以为了探究GmWRI1a基因的功能,本研究提取大豆东农47基因组DNA,分离大豆GmWRI1a基因的启动子pGmWRI1a,定向替换CAMV35S（Cauliflower mosaic virus35S）组成型启动子,驱动下游GUS基因的表达。并通过5’端缺失法构建pGmWRI1a启动子缺失片段表达载体转化模式植物拟南芥,对GmWRI1a基因启动子分子结构及功能进行了分析,初步阐明了pGmWRI1a启动子调控基因表达的分子基础,探究了pGmWRI1a启动子在植物生长中的调控作用,为深入研究GmWRI1a基因的功能奠定了良好的基础。研究结果如下:1.应用PCR技术克隆了大豆GmWRI1a基因的启动子pGmWRI1a,通过在PLACE网站上对启动子全长1669 bp的序列进行分析,发现该启动子不仅含有TATA-box、CAAT-box核心启动子区域,还存在多种顺式作用元件,如含有与乙烯有关的基序（ERE）,与赤霉素有关的基序（P-box、GARE-motif）,与茉莉酸有关的基序（CGTCA-motif）,ABA响应元件CE3和光响应元件G-box、GA-motif、ACE、AE-Box、ATC-motif、CATT-motif和GT1-motif等。2.构建了GmWRI1a基因的启动子植物表达载体并转化拟南芥,在正常培养条件下,通过GUS组织化学染色试验发现,GmWRI1a启动子能够驱动GUS基因在拟南芥的根、茎、叶、花中表达。在转基因拟南芥幼苗时期的下胚轴表达较弱。在花瓣、雄蕊和雌蕊柱头都有表达。结果表明:GmWRI1a启动子在转基因拟南芥整个生育期均能驱动GUS基因表达。3.根据pGmWRI1a启动子主要顺式元件的分布,采用启动子5’端缺失法,分别扩增得到4个pGmWRI1a启动子5’端缺失片段1138 bp,1087 bp,690 bp和437 bp构建植物表达载体,并利用花序法转化拟南芥。通过启动子转录起始位点的预测和各启动子缺失片段驱动GUS报告基因的表达结果,初步确定pGmWRI1a启动子转录起始位点位于-690～-437 bp之间。并分别利用2 mM赤霉素、0.1 mM茉莉酸及0.2 mM乙烯处理转基因拟南芥,通过GUS酶活性检测,初步确定乙烯的响应元件位于-1138～-1087 bp之间,茉莉酸的响应元件位于-1087～-690 bp,赤霉素的响应原件位于-690～-437 bp之间,干旱的响应原件位于-1087～-690 bp之间。4.利用2 mM赤霉素、0.1 mM茉莉酸及0.2 mM乙烯处理大豆DN47植株,经过qRT-PCR检测发现GmWRI1a基因受赤霉素和乙烯的正向调控,而茉莉酸对GmWRI1a基因没有明显的调控作用。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 前言
  •   1.1 植物启动子
  •   1.2 植物启动子的结构特点
  •   1.3 启动子的分类
  •     1.3.1 组成型启动子
  •     1.3.2 诱导型启动子
  •     1.3.3 组织特异性启动子
  •   1.4 启动子的克隆方法
  •     1.4.1 利用启动子探针载体筛选启动子
  •     1.4.2 利用PCR技术克隆启动子
  •   1.5 启动子功能研究方法
  •     1.5.1 点突变分析
  •     1.5.2 凝胶阻滞分析
  •     1.5.3 瞬间表达分析
  •   1.6 WRI1基因的研究进展
  •   1.7 本研究的目的与意义
  •   1.8 技术路线
  • 2 材料与方法
  •   2.1 试验材料和试剂
  •     2.1.1 植物材料
  •     2.1.2 菌种及载体
  •     2.1.3 主要试剂
  •     2.1.4 主要仪器
  •   2.2 试验方法
  •     2.2.1 GmWRI1a基因启动子及缺失片段的克隆
  •     2.2.2 GmWRI1a基因启动子全长序列分析
  •     2.2.3 植物表达载体转化农杆菌
  •     2.2.4 农杆菌介导花序浸泡法转化拟南芥
  •     2.2.5 GUS基因在转基因拟南芥植株中的检测
  •     2.2.6 转基因拟南芥的激素和逆境处理
  •     2.2.7 大豆DN47 植株的激素处理
  •     2.2.8 qRT-PCR测定不同处理下大豆GmWRI1a基因的表达
  • 3 结果与分析
  •   3.1 大豆GmWRI1a基因启动子的克隆及顺式作用元件分析
  •     3.1.1 大豆GmWRI1a基因启动子序列的获得
  •     3.1.2 大豆GmWRI1a基因启动子顺式作用元件分析
  •   3.2 大豆GmWRI1a基因启动子植物表达载体构建及转化拟南芥的鉴定
  •     3.2.1 大豆GmWRI1a基因启动子植物表达载体构建
  •     3.2.2 pBI121GmWRI1a::GUS重组表达载体转化农杆菌及鉴定
  •     3.2.3 pBI121GmWRI1a::GUS转化拟南芥及鉴定
  •   3.3 大豆GmWRI1a基因启动子缺失片段的克隆及转化拟南芥的鉴定
  •     3.3.1 大豆GmWRI1a基因启动子缺失片段的获得
  •     3.3.2 大豆GmWRI1a基因启动子缺失片段植物表达载体构建
  •     3.3.3 大豆GmWRI1a基因启动子缺失片段表达载体转化农杆菌
  •     3.3.4 大豆pGmWRI1a启动子缺失片段表达载体转化拟南芥
  •     3.3.5 核心启动子的确定
  •   3.4 GmWRI1a基因全长及各缺失片段启动子的功能分析
  •     3.4.1 标准曲线的确定
  •     3.4.2 转基因拟南芥激素处理下的GUS酶活性检测
  •     3.4.3 转基因拟南芥逆境胁迫下的GUS酶活性检测
  •   3.5 GmWRI1a基因在大豆植株不同激素处理下的表达量分析
  • 3）对GmWRI1a基因表达量的影响'>    3.5.1 赤霉素（GA3）对GmWRI1a基因表达量的影响
  •     3.5.2 乙烯（ETH）对GmWRI1a基因表达量的影响
  •     3.5.3 茉莉酸（JA）对GmWRI1a基因表达量的影响
  • 4 讨论
  •   4.1 启动子研究方法
  •   4.2 GmWRI1a基因启动子的序列分析
  •   4.3 GmWRI1a基因的功能分析
  • 5 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 邵宇鹏

    导师: 王志坤

    关键词: 大豆,启动子,基因,组织化学染色,功能鉴定

    来源: 东北农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,农作物

    单位: 东北农业大学

    分类号: S565.1;Q943.2

    总页数: 73

    文件大小: 3442K

    下载量: 446

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