激活细胞内天然免疫抑制乙型肝炎病毒和艾滋病毒感染

论文摘要

第一部分激活肝星状细胞Toll样受体3（TLR3）抑制乙型肝炎病毒复制乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）是一种嗜肝性DNA病毒,可引起乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌,是人类面临的主要公共健康问题之一。使用干扰素（Interferon,IFN）和/或核苷类似物是治疗HBV感染的首选方法。由于不能清除细胞内病毒的cccDNA,目前的治疗不能治愈HBV感染。尽管绝大多数成年人在接种乙肝疫苗后可产生强效持久的保护性抗体,但仍有5-10%的成年人对疫苗不产生免疫反应。因此,研发治愈HBV的药物和更高效的疫苗仍是目前的研究重点。本项目旨在研究肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSC）是否参与抗HBV的天然免疫。HSC是一种肝周细胞,位于肝实质细胞和肝窦内皮细胞之间。HSC参与肝脏纤维化的过程。肝脏损伤可激活HSC,活化的HSC促进细胞外基质的迁移和沉积,导致肝脏纤维化。近年来的研究证明HSC在肝脏免疫中也发挥作用。然而,目前尚未有关HSC在肝脏抗HBV天然免疫中的报道。作为一种识别病毒感染的重要模式受体,TLR3可识别病毒的双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）,启动细胞内的天然免疫反应。在本研究中,我们使用dsRNA模拟物（PolyI:C）激活HSC内的TLR3信号通路,检测其对IFN及下游抗病毒因子的诱导作用。结果显示,PolyI:C能显著激活HSC的TLR3信号通路,诱导干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor 3,IRF3）和IRF7磷酸化,选择性地上调IFN-β和IFN-λ表达。TLR3激活诱导IFN的产生与RIG-I信号通路无关。TLR3激活的HSC培养上清可显著抑制HBV在肝细胞（HepG2）中的复制。使用IFN-β和IFN-λ受体的中和抗体预处理HSC上清,可阻断其介导的抗HBV作用,表明这两种IFN在抗HBV中均发挥作用。机制研究发现,HSC上清可激活HepG2细胞内JAK/STAT信号通路,诱导表达干扰素刺激因子 IFN-stimulatedgene,ISG)。这些ISG（ISG20、ISG54、ISG56、OAS-1、Trim25和Trim22）可在HBV复制的不同阶段发挥干扰和/或抑制作用。上述发现表明,激活肝脏内的非HBV靶细胞（旁观者细胞）的TLR3/干扰素信号通路可产生多种抗HBV的细胞因子,抑制HBV在肝细胞中的复制。我们的研究为研发激活肝脏内天然免疫为基础的HBV治疗提供了重要的实验证据。未来的研究需使用动物或人肝脏组织进一步证明HSC在肝脏抗HBV天然免疫中的作用。第二部分激活DNA感受器抑制人类免疫缺陷病毒感染巨噬细胞天然免疫是宿主抵抗病毒感染的第一道防线。由于可识别病毒DNA并激活抗病毒免疫反应,DNA感受器是细胞内天然免疫系统的重要组成部分。目前已知细胞内存在多个可识别多种病毒的DNA感受器。胞质内的DNA感受器识别病毒DNA并诱导宿主细胞产生IFN抑制病毒。研究发现,HIV复制过程中产生的RNA:DNA中间体、单链DNA（single-stranded DNA,ssDNA）和双链DNA（double-stranded DNA,dsDNA）均可被DNA感受器识别。巨噬细胞是体内重要的免疫细胞,在抵抗HIV感染过程中发挥重要作用。然而,巨噬细胞是HIV的重要靶细胞,HIV通过各种机制逃逸巨噬细胞内的抗病毒天然免疫在细胞内生存和复制,形成持续和潜伏感染。因此,激活巨噬细胞的天然免疫对抑制和清除HIV感染至关重要。本课题旨在探究激活巨噬细胞DNA感受器对HIV感染/复制的作用及其机制。我们使用DNA感受器的配体poly（dA:dT）和poly（dG:dC）刺激巨噬细胞,激活细胞内DNA感受器信号通路,启动天然免疫应答。本研究发现,激活巨噬细胞的DNA感受器可显著抑制HIV感染巨噬细胞。机制研究发现,DNA感受器激活促进巨噬细胞内干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor,IRF3）和IRF7磷酸化,上调I型和III型IFN表达。分泌和释放的IFN与细胞表面IFN受体结合,激活JAK/STAT信号通路,产生干扰素刺激基因（Interferon stimulate genes,ISG）:ISG15、ISG56、Viperin、OAS2、GBP5、MxB和Tetherin)和抗HIV的微小RNA（microRNA:miRNA-29c、miRNA-138、miRNA-146a、miRNA-155、miRNA-198和miRNA-223）。这些抗病毒因子可在HIV复制周期的不同阶段发挥抗病毒作用。这些抗HIV因子的作用与干扰素表达相关,因为抗干扰素受体的中和抗体可阻断它们的抗HIV作用。此外,我们发现DNA感受器激活的巨噬细胞高表达CC趋化因子,显著降低HIV进入巨噬细胞后的逆转录产物Strong Stop DNA的表达。这些结果表明激活DNA感受器诱导产生的CC趋化因子可通过竞争性结合HIV进入辅助受体抑制病毒进入巨噬细胞。

论文目录

论文研究目的和创新点

摘要

Abstract

第一部分肝星状细胞Toll样受体3（TLR3）激活抑制乙型肝炎病毒感染

第一章前言

1.1 乙型肝炎病毒

1.1.1 概述

1.1.2 HBV病毒结构和复制周期

1.2 肝脏天然免疫与HBV

1.2.1 Toll样受体信号通路

1.2.2 RIG-I样受体信号通路

1.2.3 干扰素信号通路及抗病毒ISG

1.3 肝星状细胞与肝脏免疫

第二章实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 细胞与质粒

2.1.2 实验耗材与试剂

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 细胞转染

2.2.3 Real time-PCR检测细胞RNA

2.2.4 ELISA检测LX-2细胞上清中IFN-β和IFN-λ1/3的表达

2.2.5 ELISA检测HepG2细胞上清中HBeAg和HBsAg的表达

2.2.6 Western blot检测细胞内蛋白表达

2.2.7 MTS检测PolyI:C对LX-2细胞的毒性作用

第三章实验结果

3.1 PolyI:C对LX-2细胞的毒性作用

3.2 PolyI:C诱导LX-2细胞表达IFN-β和IFN-λ

3.3 PolyI:C诱导LX-2细胞内IRF3和IRF7激活

3.4 TCI抑制PolyI:C诱导的IFN和IRF表达

3.5 TLR3激活的LX-2细胞上清对HBV的抑制作用

3.6 LX-2细胞产生的IFN在抗HBV作用中发挥重要作用

3.7 PolyI:C处理的LX-2细胞上清诱导HepG2细胞表达ISG

3.8 PolyI:C处理的LX-2细胞上清激活HepG2细胞JAK/STAT信号通路

第四章讨论

第二部分激活胞质DNA感受器抑制人类免疫缺陷病毒感染巨噬细胞

第一章研究背景

1.1 HIV/AIDS

1.1.1 HIV/AIDS概述

1.1.2 HIV结构和复制周期

1.1.3 HIV治疗

1.2 DNA感受器与天然免疫

1.2.1 DNA感受器概述

1.2.2 DNA感受器与HIV

1.3 IFN信号通路与HIV

1.4 MicroRNA与HIV感染

1.5 CC趋化因子和HIV感染

第二章实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验耗材与试剂

2.1.2 细胞

2.1.3 病毒株

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 细胞转染

2.2.3 细胞活力检测

2.2.4 HIV病毒感染

2.2.5 细胞内总RNA提取及逆转录PCR

2.2.6 Real time-PCR检测细胞内mRNA和HIV病毒RNA表达

2.2.7 Real time-PCR检测巨噬细胞内microRNAs表达

2.2.8 巨噬细胞上清中HIV逆转录酶（HIV RT）活性检测

2.2.9 提取巨噬细胞内DNA检测HIV Strong Stop DNA水平

2.2.10 Western blot检测巨噬细胞蛋白表达

2.2.11 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测巨噬细胞上清中蛋白的表达

2.2.12 中和抗体抑制IFN与其受体结合实验

2.2.13 共聚焦显微镜观察感染或未感染的巨噬细胞形态

第三章实验结果

3.1 Poly（dA:dT）或poly（dG:dC）对巨噬细胞的毒性作用

3.2 DNA感受器激活对HIV感染的影响

3.3 DNA感受器激活诱导巨噬细胞表达IFN-β和IFN-λ1

3.4 DNA感受器激活诱导巨噬细胞IRF3和IRF7磷酸化

3.5 Poly（dA:dT）激活巨噬细胞JAK/STAT信号通路

3.6 DNA感受器激活诱导巨噬细胞内抗HIV ISG表达

3.7 DNA感受器激活诱导CC趋化因子抑制HIV病毒进入巨噬细胞

3.8 Poly（dA:dT）和poly（dG:dC）刺激诱导抗HIV microRNA表达

第四章讨论

参考文献

缩略词表

读博期间发表的文章

毕业感言和致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张标

导师: 霍文哲

关键词: 肝星状细胞,乙型肝炎病毒,干扰素,样受体,干扰素刺激基因,感受器,趋化因子

来源: 武汉大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 武汉大学

分类号: R392

总页数: 99

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激活细胞内天然免疫抑制乙型肝炎病毒和艾滋病毒感染

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