刘继洪[1]2004年在《人甲胎蛋白基因原核克隆和表达》文中研究表明甲胎蛋白(Alpha-Fetoprotein，AFP)是个70kDa的糖蛋白，在胎儿期由胎肝大量合成，在出生后则表达急剧下降。由于甲胎蛋白在原发性肝癌中也有高表达，既往多将甲胎蛋白用于肝癌的早期诊断和病情监测。最近研究表明，甲胎蛋白有着复杂的生物学功能，具有既能抑制免疫功能间接促进肿瘤细胞生长又能直接促进肿瘤细胞生长的双重作用。同时，甲胎蛋白多肽片断在和MHC分子结合后能被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所识别。因此，作为原发性肝癌的肿瘤相关性抗原(TAA)，甲胎蛋白完全有可能充当肝癌免疫治疗的靶分子。但从人血中提取纯化甲胎蛋白的量小且成本昂贵。本实验通过大肠杆菌等基因工程菌获得重组甲胎蛋白，为进一步研究开发甲胎蛋白抗肿瘤奠定了基础。 1．人AFP基因的获取 用Trizol从人胎肝组织提取mRNA，再逆转录成cDNA。设计并合成AFP1、AFP2、AFP3叁对基因引物，两端设计与载体多克隆位点匹配的酶切位点BamH Ⅰ、Hind Ⅲ，以cDNA为模板分别作PCR，分别获取AFP1、AFP2、AFP3基因片段。各PCR产物长度：AFP1为588bp；AFP2为678bp；AFP3为734bp。 2．pGEMEX-AFP1、pGEMEX-AFP2、pGEMEX-AFP3重组质粒的构建 以BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切AFP1、AFP2、AFP3基因片段，酶切产物与经同样酶切的pGEMEX-1在纯化后用T4 DNA连接酶作粘端连接，得到pGEMEX-AFP1、PGEMEX-AFP2、pGEMEX-AFP3重组质粒。以PCR和酶切方法筛选鉴定重组质粒。最后经测序证实各序列已完整无误的插入pGEMEX-1载体。—加声，认掌-岔二竺些些竺塑生生兰一一一一一一一—3·pGEMEx一AFH、pGEMEx一AFpZ、pGEMEx一AFP3重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达pGEMEX一AFPI、pGEMEX一AFPZ、pGEMEX一AFP3重组质粒转化至BL21(DE3)菌株后，从基因和蛋白质水、{乙对pGEMEX一AFPI、pGEMEX一AFPZ、pGEMEX一AFP3进行检测基因检测仍用PCR法，结果发现转化了pGEMEX一AFPI、pGEMEX一AFPZ·pGEMEX一AFP3的菌株分别出现了588bp、678bp、734bp的阳性条带。重组质粒转化菌株用I盯G诱导后，行全菌SDS一PACE，结果出现预计的融合蛋白条带二转化了pGEMEx一AFPI、PGEMEX一AFpZ·PGEMEX一AFp3的菌株分别出现了约55kDa、59kDa、5八Da的蛋白条带，经Western blot证实各融合蛋白均有免疫反应性。结论:1.成功构建了重组质粒pGFMFX一AFm、pGEMEX一AFPZ、pGEMEX一AFP3，经序列分析证实对码、序列无误。2.SDS一PAGE证实经重组质粒pCEMEX一AFm、pGEMEX一AFPZ、pGEMEX一AFP3转化的大肠杆菌BL21(DE3)能够成功表达AFPI、AFPZ、AFP3融合蛋白。3.免疫印迹法证实重组质粒pGEMEX一AFPI、pGEMEX一AFPZ、pGEMEX一AFP3转化的大肠杆菌BL21(DE3)表达的AF代、AFPZ、AFP3融合蛋白具有免疫反应性。
刘继洪, 朱海红, 陈智, 朱曼华, 蒋汉良[2]2004年在《人甲胎蛋白基因的克隆和表达》文中研究说明目的 构建表达人甲胎蛋白(AFP)的重组质粒,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白.方法 用PCR方法从人胎肝组织中扩增AFP基因片断,将其转入原核载体质粒pGEMEX 1,在大肠杆菌DH5α中克隆,并在BL21DE3中表达.结果 重组质粒pGEMEX AFP的AFP基因序列经分析与GenBank公布序列相符,各表达的蛋白经WesternBlot检测有抗原性.结论 基因重组菌表达的融合蛋白有可能作为有效的肿瘤抗原.
李振东, 谷华玮, 王海鹰, 陈淑仪, 宁正祥[3]2013年在《人甲胎蛋白AFP在大肠杆菌中表达和鉴定》文中指出本研究通过应用基因工程技术,重组构建编码人全长甲胎蛋白AFP基因的原核表达载体pET22b-AFP,并将其转化到大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)中进行诱导表达目的蛋白AFP。采用PCR法扩增编码AFP蛋白的cDNA序列片段,并将其克隆到含有His-tag的pET22b原核表达载体上;重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达;对诱导过程中不同浓度的IPTG和不同的温度进行优化;选定最佳的优化条件进行诱导表达目的蛋白;SDS-PAGE电泳和Western Blot法鉴定表达产物。结果表明,通过PCR扩增技术获得了编码AFP蛋白的基因片段;重组质粒经双酶切和基因测序等方法鉴定后,确认了重组质粒已经构建成功;表达产物通过利用SDS-PAGE和Western Blot法检测到在66 kDa附近出现条带,与预期值相符,表明重组AFP蛋白已成功表达。
姬晓南, 张瑜, 冯丽亚, 高向东[4]2013年在《抗人甲胎蛋白单链抗体融合蛋白的构建、表达及初步鉴定》文中进行了进一步梳理甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)是重要的肝癌诊断标记物,在肝癌的进展过程中扮演重要角色。构建具有免疫学活性的抗人AFP单链抗体,为进一步的研究奠定实验基础。采用RT-PCR技术,从分泌抗人AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞中扩增mAb抗体可变区的VH、VL基因,并进一步将其组装成VH-Linker-VL型的ScFv片段。将ScFv片段亚克隆至质粒pET32a中,将重组质粒转染大肠杆菌BL21并IPTG诱导表达ScFv蛋白,利用肠激酶切除Trx标签后,经镍柱亲和层析获得蛋白,竞争抑制ELISA法初步鉴定活性,竞争抑制率达到54.13%。
才蕾, 矫丽媛, 王继华, 唐时幸[5]2015年在《甲胎蛋白的原核表达及复性优化》文中研究指明构建甲胎蛋白的原核表达载体p ET32a-AFP,对包涵体形式表达的甲胎蛋白进行复性优化。将构建的重组质粒p ET32a-AFP转化入E.coli,IPTG诱导表达后,经亲和层析纯化获得AFP包涵体,通过对复性过程、p H、添加剂等的研究摸索,获得最佳复性条件。当采用添加0.5 mol/L L-精氨酸的一步法透析复性方法,且透析液p H值为8.5,重组人AFP包涵体蛋白起始浓度为1.0 mg/m L时,复性效率最高。该复性方法获得蛋白质具有较高的回收率且操作简便。
参考文献：
[1]. 人甲胎蛋白基因原核克隆和表达[D]. 刘继洪. 浙江大学. 2004
[2]. 人甲胎蛋白基因的克隆和表达[J]. 刘继洪, 朱海红, 陈智, 朱曼华, 蒋汉良. 科技通报. 2004
[3]. 人甲胎蛋白AFP在大肠杆菌中表达和鉴定[J]. 李振东, 谷华玮, 王海鹰, 陈淑仪, 宁正祥. 现代食品科技. 2013
[4]. 抗人甲胎蛋白单链抗体融合蛋白的构建、表达及初步鉴定[J]. 姬晓南, 张瑜, 冯丽亚, 高向东. 药物生物技术. 2013
[5]. 甲胎蛋白的原核表达及复性优化[J]. 才蕾, 矫丽媛, 王继华, 唐时幸. 生物技术通报. 2015
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