论文摘要
目的利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术,构建基质Gla蛋白(MGP)基因敲除的RAW264.7巨噬细胞系,明确MGP基因在破骨细胞分化过程中的作用。方法利用在线软件分析并筛选出3个针对MGP基因外显子区的单链向导RNA(gRNA),人工合成gRNA寡核苷酸序列,并将其插入线性化的LentiCRISPRv2质粒中,构建成LentiCRISPRv2-MGP-gRNA重组质粒。将重组质粒与psPAX2、VSVG包装质粒一同转染293-T细胞,包装并收集重组慢病毒,将其感染RAW264.7细胞。经嘌呤霉素筛选得到稳定RAW264.7细胞系,实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qPCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)验证MGP m RNA及蛋白表达水平。q PCR检测破骨细胞分化标志分子的表达情况。结果成功构建了LentiCRISPRv2-MGP-gRNA重组质粒,成功包装了含有MGP-gRNA的重组慢病毒,筛选得到了稳定低表达MGP的RAW264.7细胞系。qPCR及蛋白质印迹法检测显示,其MGP mRNA、蛋白表达显著性下调(P<0.05)。q PCR结果显示,最具有代表性的LentiCRISPRv2-MGP-gRNA1细胞破骨标志分子Itgb3(2.29±0.17)、Acp5(2.86±0.15)、Ctsk(2.07±0.13)的mRNA水平均显著上调(P<0.05)。结论利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术成功构建了MGP基因敲除的RAW264.7细胞系,敲除MGP后RAW264.7细胞破骨分化能力增强。
论文目录
文章来源
类型: 期刊论文
作者: 赵俐婷,王乃宁,贺芳,张燕
关键词: 基因敲除技术,骨钙素,破骨细胞,转染
来源: 安徽医药 2019年12期
年度: 2019
分类: 医药卫生科技,基础科学
专业: 生物学,基础医学
单位: 西安交通大学第一附属医院转化医学中心,西安交通大学生命学院
基金: 国家自然科学基金项目(81670806,81972133,81300716),中央高校基本科研业务费(xzy01201909),陕西省自然科学基础研究计划(2017JM8015)
分类号: R329.2
页码: 2361-2365
总页数: 5
文件大小: 2012K
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