陈雄芳[1]2004年在《大黄鱼精子和胚胎的超低温保存研究》文中研究表明近五十年来，超低温保存种质细胞技术已经趋于成熟，特别是近几年对海洋动物种质细胞的研究力度也开始逐渐加大。本研究结合国家高技术研究发展计划(863计划)中“重要海水养殖鱼类配子和胚胎的低温保存技术及其种子库的建立”课题研究项目，进行了大黄鱼精子和胚胎超低温保存实验，得到了他们在液氮(-196℃)条件下的适宜保存条件。 在大黄鱼精子超低温保存实验中，逐个筛选了方案中各个因素的最佳水平。实验筛选了二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、甘油(GLY)、丙二醇(PG)和甲醇(METH)五种抗冻剂配合X1—X5五种稀释液和叁种添加剂的冷冻效果，发现X5+Gly10％+海藻糖0.015g／ml的抗冻溶液效果最好，可获得冻精复活率，授精率和孵化率分别为92％，48.8％和51％。本实验就降温过程筛选了程序降温法，分步投氮法和其二者相结合的方法，就复温过程筛选了28℃、43℃和70℃水浴解冻的各种方法。其中在液氮罐内-15℃位置停留10min后再在液氮面停留5min，然后投氮的两步投氮快速冷冻法加上43℃水浴解冻至完全融解效果最好，能达到85.3％的冻精复活率。而且这是操作最简单、历时最短的冷冻方法，适合生产现场应用。当稀释比为1：3时，不同样品体积对精子冷冻效果区别不大；当冻积为0.5ml时，精子稀释比1：3时冷冻效果最好。实验还用到精子动(静)态图像分析系统分析冻精活力情况，测出最佳冷冻方案冻精活动率为93.75％，其中快速向前运动的占50.0％。 在大黄鱼胚胎超低温保存实验中，逐个筛选了方案中各个因素的最佳水平。实验筛选了DMSO、GLY、PG和METH四种抗冻剂配合稀释液和添加剂的冷冻效果，抗冻剂METH对胚胎的毒性最小而GLY毒性最大，胚胎在20%METH中平衡40分钟仍可保持81.8%的复活率，而在20%GLY中6分钟复活率就低于80%。且METH能使胚胎经超低温保存后保持形态最完整，能达到60%的形态完整率，而使心跳期胚胎经超低温保存后形态受损最严重的是PG，胚体大多数发白且成粉碎状。大黄鱼胚胎的超低温保存的最适抗冻液为X3+20%METH，0.159/ml乙酞胺能部分降低METH毒性，而METH10%+GLY10%能提高冷冻效果。一30℃为大黄鱼心跳期胚胎超低温保存的危险下限温度，从一30℃降到一40℃胚胎复活率从40一80%降为趋向于。。大黄鱼胚胎的超低温保存的最适降温方法为:一5℃·min一‘O℃---------一--一今一30℃(lmin)一30oC·min一‘一一一一一一一一一一一一一一令一180℃今NZ 最适复温方法为一80℃(Zmin)一舰3℃水浴解冻至融解1/2，再移到室温解冻到完全融解，最适洗脱方法为在0.5M蔗糖溶液中洗脱10分钟后移入海水孵化。在一26℃对样品植冰可提高胚胎超低温冷冻后的形态完整率46.8%。叁者配合虽然没有得到复活胚胎，但能得到84.8%胚体、卵膜、卵黄囊和油球等形态都基本正常的胚胎。
陈亚敏[2]2013年在《鞍带石斑鱼精子低温保存研究》文中研究表明鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)是我国东南沿海性状优良、经济价值高的名贵海产食用鱼类。然而其雌雄配子成熟不同步，极大限制了大规模种苗的培育，随着近年来配子保存技术的发展，精液的低温储存和超低温冷冻保存技术可以很好地解决这一问题。本文摸索了鞍带石斑鱼精子在4℃低温保存和超低温冷冻保存的适宜条件，伊红Y染色法检测了冷冻保存前后精子质膜的完整性，同时应用试剂盒法检测了冷冻精子中总叁磷酸腺苷酶(ATP酶)、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等酶活性，从精子结构、生化组成等方面揭示了超低温冷冻保存对精子结构和功能的影响，建立了鞍带石斑鱼精子低温保存方案和超低温保存方案，同时初步阐明了精子冷冻损伤机理。1.鞍带石斑鱼精子4℃低温保存研究（1）分别在改进后的Mounib’s盐溶液（MMM）、Hank’s盐溶液（HBSS）和150mM NaCl3种保存液中低温保存精子。结果表明，精子激活率、快速运动时间和寿命均随着低温保存时间的延长而降低；在所有观察时段里，保存在MMM溶液中的精子其激活率、快速运动时间和寿命均高于保存在HBSS和150mM NaCl溶液中的精子，且在保存96h后，其激活率仍可达60%以上。（2）随着精液与保存液MMM稀释比例从1:1增大到1:100，经24h保存后的精子激活率、快速运动时间和寿命呈现先升高后降低的趋势；而稀释比例增大到1:50时，精子激活率最高，达89.6%；稀释比例为1:20时，精子快速运动时间和寿命达最高，平均分别为21.3min和23.3min。（3）在2ml离心管中分别保存200、500、800、1100和1400μl精子，随着保存体积的增加，精子激活率呈现先上升后降低的趋势，当保存体积为800μl时，精子激活率、快速运动时间和寿命最高，平均分别达89.1%、20.2min和22.3min。2.鞍带石斑鱼精子超低温冷冻保存研究（1）分别用MMM，HBSS和150mM NaCl稀释鞍带石斑鱼精子进行超低温冷冻保存，并于7d后解冻检测其激活率、快速运动时间、寿命、存活率以及总ATP酶、LDH、GSH-PX、总SOD酶活性。结果表明，用MMM溶液稀释保存的精子其各项指标均显着高于HBSS和150mM NaCl稀释保存的精子；而当抗冻剂为15%DMSO时，精子激活率、存活率以及总ATP酶、LDH酶、GSH-PX酶、总SOD酶活性均最高，平均分别为63.3%、69.91%、2.0771umolPi/108个sperm/hour、8660.14U/L、551.84U/L、277.45U/ml，同时精子运动时间和寿命也最长，平均分别为为15.9min和17.4min。（2）随着精液中添加的二甲基亚砜（DMSO）浓度从5%增加至20%，冷冻保存7d后的精子激活率、存活率、总ATP酶、LDH酶、GSH-PX酶、总SOD平均酶活力均呈现先升高后下降的趋势。其中，浓度为15%时，精子激活率和存活率和4种酶活力均达最高，分别为64.3%和68.83%、3.062umolPi/108个sperm/hour、11833.33U/L、602.67U/L和365.28U/ml；快速运动时间和寿命也最长，平均分别为16.1min和18.93min。（3）随着稀释后的精液中添加海藻糖浓度5%增加至20%，超低温保存后的精子激活率和存活率逐渐升高，精子快速运动时间和寿命延长。当浓度为20%时，激活率和存活率最高，平均分别为54.52%和56.97%，快速运动时间和寿命也最长，平均分别为8.5min和17.4min。（4）经MMM和15%DMSO稀释的精液，采取在液氮面上3cm至12cm高度停留5min后投入液氮的两步降温法进行超低温冷冻保存研究。结果表明，冻精解冻后的激活率和存活率随着高度的增加呈先升高后下降的趋势，总ATP酶、LDH酶、GSH-PX酶、总SOD酶活力无显着差异，当高度为6cm时，激活率，快速运动时间、寿命和存活率均达到最高，平均分别为63.91%、16.8min、18.5min和71.72%。（5）精液经不同稀释倍数（2、10、20、50和100倍）稀释后超低温冷冻保存研究。结果表明，当稀释倍数为2、10和20倍时，精子激活率差异不显着；精子稀释10倍冷冻，解冻后获得了最高的激活率，快速运动时间和寿命，平均分别为64.96%，14.2min和16.1min；当稀释倍数从10倍增大到100倍，冻精解冻后的激活率、快速运动时间和寿命逐渐降低。（6）超低温冷冻保存的精子悬液冰上平衡不同时间（5，15，30和60min）后解冻，激活率随着平衡时间的延长而逐步降低，快速运动时间和寿命也随之缩短，；将冰上平衡5min后的精子悬液投入液氮保存，获得最高的精子激活率和最长的精子快速运动时间和寿命，平均分别为64.98%、14.1min和15.13min；未经平衡即投入液氮保存的精子激活率较低；而精子悬液在液氮面上高度6cm处停留5，15，30和60min，冻精解冻后的激活率和寿命无显着差异。（7）分别在4个不同温度（35℃，37℃，39℃和41℃）中水浴解冻经超低温冷冻保存的同一处理精子，其激活率、快速运动时间和寿命无显着差异，且均高于43℃水浴中解冻的精子。综上，本文研究结果表明，保存液和保存体积会影响鞍带石斑鱼精子4℃低温保存的效果，而冷冻稀释液、抗冻剂种类和浓度、降温方式、冷冻前冰上平衡时间和稀释倍数会影响鞍带石斑鱼精子超低温冷冻保存的效果。
王小刚[3]2010年在《点带石斑鱼精子种质保存研究》文中研究指明点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)是我国东南沿海重要的名贵海水养殖经济鱼类。目前对点带石斑鱼的生物学研究及其人工繁育技术已相当成熟,而对该鱼的精子种质保存技术尚未开展研究。本论文对点带石斑鱼的精子活力、超低温冷冻前后的精子超微结构的差异和精子超低温冷冻保存进行了较详细的研究,为点带石斑鱼精子低温冷冻保存和低温精子种质库的建立提供理论依据。通过设置盐度和pH梯度,研究了盐度、pH值对点带石斑鱼精子活力的影响；同时利用电子显微镜技术对点带石斑鱼精子的超微结构进行了观察,比较了超低温冷冻前后精子超微形态结构的差异。研究结果表明：(1)该鱼精子活力的适宜盐度范围为15-35,盐度为15时,精子寿命最长为26min；最适pH值范围为6.5-8.0。(2)正常的点带石斑鱼精子由头部、中段和尾部叁部分组成,精子头部呈球圆形或近圆形,直径约1.8μm；中段不明显,可见线粒体；鞭毛细长,约15μm,尾部主要结构是轴丝,为典型“9+2”微管结构。(3)超低温冷冻保存后,点带石斑鱼精子的形态结构损伤明显,主要表现为质膜褶皱、破裂,细胞质外漏,线粒体膨胀破损,脱落和鞭毛断裂等特征。通过选用TS-19、TS-2、Hank's、MPRS、Cortland、0.75% NaCl等作为稀释液及10%-25%二甲亚砜(DMSO)、甘油(Gly)、甲醇(MeOH)作为抗冻液,对繁殖季节中3个不同时期的点带石斑鱼精液进行超低温冷冻保存研究。研究结果表明：(1)Hank's溶液为点带石斑鱼精子冷冻保存最适冷冻稀释液；(2)点带石斑鱼精子保存的最适冷冻保护液组合为Hank's溶液与10%-15%DMSO溶液,可以获得60%以上的冻精成活率,而使用不同浓度的MeOH作为抗冻液时,冻精成活率均为O%；(3)以10%-25%Gly作为抗冻液时,冷冻前未加天然海水时均能激活点带石斑鱼精子正常运动,效果与天然海水相似,加入天然海水后精子运动效果急剧下降,精子冷冻保存后也存在同样现象；(4)为保证获得更高的冻精成活率,点带石斑鱼精液冷冻保存样品的最佳获取时期是在亲鱼排精前1天进行为宜。
韩龙江[4]2015年在《几种海洋经济动物种质资源超低温冷冻保存研究》文中研究说明种质资源是海水养殖生产、优良品种培育及海洋渔业可持续发展的重要物质基础。然而,随着海水养殖业的快速发展,海洋动物核心种质鉴定和保护研究严重滞后的负面效应日益突出。超低温保存技术是种质细胞长期保存的重要方法,相关理论与技术的发展,对于种质资源的保护、遗传改良以及养殖业的可持续发展有着重要应用价值和理论意义。1.太平洋鳕精液超低温冷冻采用分步降温法冷冻保存太平洋鳕(Gadus macrocephalus)精液,并用扫描电镜和透射电镜技术研究了精子的超微结构损伤。分析了添加剂(蛋黄)及五种抗冻剂(PG(丙二醇)、DMSO(二甲基亚砜)、EG(乙二醇)、GLY(甘油)、MeOH(甲醇))不同浓度(8%、10%、12%、14%、16%、18%)对太平洋鳕精子冷冻保存效果的影响。实验结果表明,蛋黄能够显着提高太平洋鳕冷冻保存效果(P<0.05)；在以HBSS为稀释液,12%PG中添加10%蛋黄保存的冻融精子运动率最高(85.87%±1.6%),显着高于其他冻存组(P<0.05)。添加蛋黄的12%浓度的DMSO组解冻后精子运动速率较高,平均直线速度、平均曲线速度、平均路径速度分别达到了(120.39±20.78)μm/s、(120.39±20.78)μm/s、 (155.64±12.02)μm/s,与其他各实验组差异显着(P<0.05)。通过扫描电镜和透射电镜观察新鲜和冻融后的鳕鱼精子发现,鲜精中75.5%精子形态结构正常、24.5%精子形态结构异常；运动率最高的冻精中67%精子形态结构正常、33%精子形态结构异常。超低温保存对太平洋鳕精子结构产生了显着影响,细胞膜破裂、线粒体肿胀变形,鞭毛脱落、断裂。2.条纹锯鮨精液超低温冷冻保存研究为建立条纹锯鮨(Centropristis striata)精液超低温冷冻保存方法,实验采用计算机辅助精子分析系统(CASA)分析了六种抗冻保护剂(GLY[甘油]、DMSO[二甲基亚砜]、PG[丙二醇]、EG[乙二醇]、MeOH[甲醇]、DMA[二甲基乙酰胺])在四种不同浓度下(5、]0、]5、20%,v/v)对条纹锯鮨精液冷冻保存的效果。结果显示：以HBSS为稀释液,采用程序降温仪分步降温冷冻保存条纹锯鮨精液,37℃水浴解冻后的精子中,15%PG作为抗冻保护剂的精子运动率最高,达到93.1±0.9%,与鲜精差异不显着(P>0.05),15%PG作为抗冻保护剂的精子水浴解冻后精子的运动速度最高,平均直线速度、平均曲线速度、平均路径速度分别达到了(88,3±0.3)μm/s、(76.2±0.5)μm/s、 (86.7±0.7)μm/s,与鲜精差异不显着(P>0.05)。在不同种类及不同浓度抗冻保护剂保护下,15%PG作为抗冻保护剂的精子解冻后1mmin内运动率变化与鲜精差异不显着(P>0.05)。研究表明,15%PG为条纹锯鮨最佳抗冻保护剂,可用于条纹锯鮨精液的超低温冷冻保存。3.太平洋牡蛎精液的超低温保存研究本研究筛选了六种抗冻保护剂(GLY[甘油],DMSO[二甲基亚砜],PG[丙二醇],EG[乙二醇],DMA[二甲基乙酰胺],MeOH[甲醇])及其五种不同浓度(6%,8%,10%,12%,14%,V/V)、叁种稀释液(无钙HBSS,人工海水[ASW],过滤海水[FSW])、四种稀释比例(1：1,1：2,1：4,1：6)、叁种添加剂(蔗糖,葡萄糖,海藻糖)、叁个分步降温程序(程序A,程序B,程序C)对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)精液冷冻保存的影响,成功建立了太平洋牡蛎精液超低温保存方法：以10%DMSO为抗冻保护剂,无钙HBSS为稀释液,1：4的稀释比例,添加0.45mol/L的海藻糖,采用分布降温法冷冻保存太平洋牡蛎的精液,37℃水浴解冻后精液运动率达到71.27%±3.24%,显着高于其它实验组(P<0.05),受精率和孵化率分别达到95.04%±1.99%、93.33%±1.33%,与鲜精(88.89%±15.16%,94.90%±0.95%)、程序冷冻前精液(95.96%±2.15%,92.67%±14.83%)差异不显着(P>0.05),证明该太平洋牡蛎精液超低温保存方法可以应用于生产实践和科学研究中。4.太平洋牡蛎精子超低温冷冻后超微结构损伤研究采用程序降温仪分步降温冷冻保存太平洋牡蛎精液,并用扫描电镜、透射电镜研究了精子的超微结构损伤。超低温冷冻保存后太平洋牡蛎精子的运动率、受精率及孵化率与鲜精无显着差异。鲜精中84.5%的精子形态结构正常,冻精中73%的精子形态结构正常。形态结构正常的精子表现为顶体、质膜、线粒体与鞭毛结构完整、染色质形状规则,顶体、线粒体及中心粒结构正常,鞭毛形态完整、微管结构清晰；形态结构异常的精子表现为顶体脱落、解体,精子头部质膜膨胀、破裂、染色质肿胀、破裂、解体,线粒体移位、脱落、膨胀,嵴退化或消失,鞭毛弯折、断裂,微管解聚。结果显示,以10% DMSO为抗冻保护剂,HBSS溶液为稀释液,1：4的稀释比例,添加海藻糖,采用分步降温法冷冻保存,对太平洋牡蛎精子具有较好的抗冻保护作用,合适的冻存方法可以有效的保护太平洋牡蛎精子冷冻过程中结构损伤。本研究将有助于太平洋牡蛎种质资源的收集保存及应用。5.太平洋牡蛎担轮幼虫的超低温保存研究本实验研究了六种抗冻保护剂GLY(甘油)、DMSO(二甲基亚砜)、PG(丙二醇)、EG(乙二醇)、DMA(二甲基乙酰胺)和MET(甲醇)在叁种不同浓度下(5%、10%、15%,v/v)对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用及冷冻保存的影响。太平洋牡蛎担轮幼虫毒性实验证明：抗冻保护剂的种类和浓度对太平洋牡蛎担轮幼虫产生的毒性强弱不同,在抗冻保护剂浓度为5%时,GLY、DMSO、 PG、EG对太平洋牡蛎的毒性作用显着低于其他抗冻保护剂(P<0.05)；随着抗冻保护剂浓度增加到10%,GLY、DMSO、EG、MET对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用显着低于其他抗冻保护剂(P<0.05)；而抗冻保护剂浓度为15%时,GLY、DMSO对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用显着低于其他抗冻保护剂(P<0.05),且随着抗冻保护剂浓度的升高,其对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用也增大。太平洋牡蛎担轮幼虫的超低温冷冻保存实验证明：以10% DMSO作为抗冻保护剂,采用分步降温法冷冻保存太平洋牡蛎担轮幼虫,28℃水浴解冻后担轮幼虫运动率达到(73.00±2.00)%,显着高于其他实验组(P<0.05),其次为GLY组,且各浓度间差异不显着(P>0.05)。该研究为太平洋牡蛎及其他贝类胚胎保存提供了科学依据,在贝类遗传育种和生物技术等方面具有一定的应用前景,具有重要的生产实践价值。
黄晓荣, 章龙珍, 庄平, 刘鉴毅, 张涛[5]2012年在《超低温冷冻保存对大黄鱼精子酶活性的影响》文中进行了进一步梳理研究超低温(-196℃)冷冻保存对大黄鱼(Pseudosiaena crocea)精子内总ATP酶、肌酸激酶(CK)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)等酶活性的影响。运用试剂盒分别测定了冷冻前后大黄鱼精子内酶活性的变化。结果表明,经过超低温冷冻保存后,大黄鱼精子的活力下降,精子内GR活性从(4.42±0.29)U·L-1增加到(58.93±2.26)U·L-1(P<0.05);其它几种酶的活性均显着下降(P<0.05),总ATP酶、CK、SDH的活性分别从冻前的(60.16±5.88)U·mL-1、(11.91±0.76)U·mL-1和(51±2.16)U·mL-1下降到(3.54±0.37)U·mL-1、(10.22±0.32)U·mL-1和(31.5±2.08)U·mL-1;LDH、SOD和CAT活性从冻前的(7 806.44±110.11)U·L-1、(42.65±1.56)U·mL-1和(119.91±8.10)U·mL-1下降到(2 654.13±70.06)U·L-1、(31.99±1.57)U·mL-1和(55.87±2.32)U·mL-1。超低温冷冻保存对大黄鱼精子活力和精子酶活性均有显着影响。
柴森浩[6]2014年在《花鲈仔鱼发育与精液低温冷冻保存研究》文中认为花鲈（Lateolabrax japonicus）在我国黄渤海、东海、南海及台湾海峡均有分布，是我国重要的经济养殖品种。本文通过珠海人工育苗试验采集花鲈仔鱼，对其早期发育进行了形态学和组织学观察，并以胶州网箱养殖花鲈为对象，对花鲈精液低温冷冻技术进行了新的探究，为花鲈的种质保存、远缘杂交和苗种规模化生产提供参考和科学依据。1.花鲈仔鱼培育及其形态学观察本实验通过人工育苗试验发现，在适温范围内，保持较高的培育水温对花鲈仔稚鱼的生长发育有着明显的促进作用；在仔鱼后期时开始进行淡化，每日以淡化2-3度为宜；最好在上午9:00及下午14:00左右仔鱼摄食高峰时期增加投饵，并且开始淡化后适当增加投饵量。采用解剖观察等方法对花鲈胚后发育形态学进行了较为详细观察，结果表明，初孵仔鱼平均全长3.71mm，卵黄囊略约占身体一半，消化道为一直形盲管，管腔狭窄；1日龄仔鱼，卵黄囊大幅缩小，消化管细长，末端稍向下弯；2日龄仔鱼，消化道左右蠕动但仍未连通，出现肝胰脏雏形；5日龄仔鱼，口裂明显，口开启，消化器官开始分化；9日龄仔鱼，卵黄囊已基本消失，消化道贯通，开口捕食轮虫；12日龄仔鱼，鳔出现，鳃盖形成；17日龄仔鱼，眼睛黑色素基本上全部出现；20日龄仔鱼，鳔充气，消化道背缘及腹部正中线上黑色素斑点增多；25日龄仔鱼，头部较大，约占体长1/4左右，鳃盖部位渐不透明，肌节不明显。2.花鲈器官早期发育的组织学观察采用组织学观察方法，研究了花鲈器官早期发育。结果表明，仔鱼出膜1~3d，消化管紧靠卵黄囊背方，管腔狭细；出膜4d，胃出现雏形；出膜7d，胃开始膨大，胃粘膜出现褶皱，上皮种类为单层柱状上皮；出膜8d，胃分化贲门部、基底部和幽门部；出膜20d，胃壁增厚，粘膜褶皱加粗变高，上皮的类型为单层立方上皮，胃贲门部出现杯状细胞。出膜3d，仔鱼肠腔略有膨大；出膜5d，仔鱼肠的后段出现略微的褶皱，上皮类型为柱状上皮；出膜8d，仔鱼开始摄食，肠上皮为纤毛柱状细胞，夹有少量杯状细胞；出膜13d，肠后部的上皮具较多杯状细胞；出膜24d，粘膜上皮纹状缘明显，肠腔内纵行褶增高、增多。肝胰脏在出膜后3d出现雏形，出膜10d逐步开始空泡化，出膜17d基本发育完全，空泡化程度加深。视网膜于出膜7d分化完全，视细胞为视锥细胞。鳃于出膜13d基本发育完全，形成4对鳃裂。3.花鲈精液低温冷冻保存研究对花鲈精子进行了4℃低温短期保存和超低温冷冻保存研究。结果表明，在4℃低温短期保存中，精子激活率（MOT），平均曲线运动速度（VCL）和平均直线运动速度（VSL）均随着保存时间延长而降低，在0~24h内，稀释液MPRS中保存的精子活力最高；但是在24h后，150mM NaCl中保存的精子活力最高，并且在保存72h后其激活率仍可达到90.9%。以MPRS作为稀释液，保存120h后，稀释比例为1:3的精子激活率仍能达到50%，此时稀释比例为1:1和1:10的精子激活率快速下降，已经低于40%。在超低温冷冻保存中，150mM NaCl表现出良好的保存效果，DMSO浓度为10%时，150mM NaCl与MPRS稀释液中保存的精子激活率均在50%以上，差异不显着（P>0.05），当DMSO浓度为20%和30%时，150mM NaCl保存效果明显优于传统的花鲈精子冷冻稀释液MPRS（P<0.05），而ELS3保存效果并不理想。DMSO在作为花鲈精子超低温冷冻抗冻剂时保存效果良好，其中DMSO浓度为20%时效果最好，海藻糖并不适宜保存花鲈精子，甚至会影响DMSO的保存效果。
姜静[7]2014年在《几种海水鱼类种质超低温冷冻保存研究》文中认为自20世纪50年代，Blaxter首次成功冰冻保存了太平洋鲱鱼(Clupea harengus)精巢后，到目前为止，种质资源的超低温冷冻保存技术已经取得了不错的成绩，并正日益趋于成熟。目前，已对200多种淡水鱼类、40多种海水鱼类的精液作了冷冻保存研究，并获得了成功保存，并建立了精子冷冻库(cryobank)。但目前还尚未取得一个统一的方法适用于各种鱼类，因此，鱼类精液冷冻保存技术还有待需要进一步的探索和推进。同时期，鱼类胚胎冷冻保存也开始了相关研究。随着生物技术和新型技术手段的不断成熟和应用，鱼类胚胎冷冻保存研究的发展也取得了迅速的推进。星斑川鲽(Platichthys stellatus, Pallas1788)隶属鲽形目(Pleuronectiformes)、鲽科(Pleuronectidae)、川鲽(Platichthys)属。主要分布于白令海峡、楚科奇海、阿拉斯加和加拿大北部沿海以及北美和南加利福尼亚等，其中，在加拿大、美国、俄罗斯、中国、朝鲜、韩国和日本等均有分布。但近些年，星斑川鲽的自然种群在我国已很少发现，并且星斑川鲽产精量少，限制了在人工繁育和杂交育种中的扩大生产。石斑鱼为雌雄同体，暖水性海水鱼类，以热带、亚热带分布居多，在我国主要分布于南海和东海。鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)和七带石斑鱼(Epinephelus septemfasciatus)隶属鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Epinephelinae)、石斑鱼属(Epinephelus)。鞍带石斑鱼体型大、生长迅速，是水产养殖业的新型品种，但其雄鱼数量少，产精量有限，这些因素的限制造成现实不能够满足实际的需求。此外，生殖隔离也阻隔了石斑鱼种间杂交的发展。七带石斑鱼是在我国黄海唯一有分布的、具有较高经济价值的种类。本实验室于2013年已对七带石斑鱼精子进行了冷冻保存，并获得了成功。目前，由于七带石斑鱼因神经坏死病的复发蔓延，该鱼产量受到了严重影响。为此，鉴于以上几种鱼类所存在的问题，开展鱼类种质保存研究是解决和保持水产养殖业可持续发展和保护鱼类遗传多样性的一种可行性方法，并且该研究的开展已迫在眉睫，势在必行。本研究分别对星斑川鲽和鞍带石斑鱼两种海水鱼类的精子进行了冷冻保存，在星斑川鲽精子冷冻保存研究中，主要对精子稀释液(种类、成分、渗透压)、激活海水适宜温度，冷冻精液的适宜稀释比例等方面进行了筛选。研究得出，利用Ts-2和SFs-4作为稀释液，10%DMSO为抗冻剂，冷冻复苏后用12℃海水激活能够获得较高的精子活力，并且利用稀释20倍的冻精用于受精实验，能够获得较高的受精率。此外，运用CASA系统对利用Ts-2和SFs-4冷冻保存的精子做了参数分析，发现利用SFs-4保存的精子各项运动参数明显高于Ts-2。在鞍带石斑鱼精子冷冻保存研究中，主要对精子稀释液种类、抗冻剂DMSO及FBS适宜浓度作了筛选。结果得出，利用ELS3和ELRS3作为稀释液，15%DMSO和10%FBS作为抗冻剂，精子的冷冻效果最好，解冻复苏后精子活力最高。同时，本研究对七带石斑鱼胚胎进行了超低温玻璃化冷冻保存，主要是从抗冻剂种类以及不同种类抗冻剂混合搭配使用对胚胎的毒性作用大小的角度，来筛选出毒性最低的最适宜的玻璃化液用于冷冻保存。研究结果发现利用35%PMG3+5%海藻糖(PMG3T)玻璃化液处理的未经冷冻的胚胎的孵化率最高为31.76%，并经冷冻保存后，发现78粒冷冻保存的卵中，解冻处理后有上浮卵6粒，并有1粒孵化出仔鱼。此外，本研究还对利用PM、PMG3、PMG3T3玻璃化液处理和冷冻保存的七带石斑鱼肌节期胚胎内的6种酶进行了测定，发现鉴于玻璃化液处理和冷冻保存后的胚胎内6种酶活性，除了MDA外，其他5种酶(SOD、CK、Na+/K+-ATPase、LDH、GSH-Px)活性均减少，表明冷冻和玻璃化液均使得胚胎细胞内的抗氧化体系遭受损伤，造成胞内能量代谢酶和某些抗氧化酶含量减少，脂质过氧化损伤等，从而降低了冷冻胚胎复活率。通过对冷冻前后胚胎内相关酶活性的测定，一定程度上为七带石斑鱼胚胎冷冻保存提供了理论依据。另外，为了更好的探索海水鱼类胚胎冷冻保存机理，本文对海水靑鳉胚胎进行了初步的研究实验，但目前尚未作出系统的研究工作，还有待日后继续进行研究。
刘金相[8]2013年在《牙鲆和圆斑星鲽杂交叁倍体诱导的初步研究》文中指出牙鲆（Paralichthysolivaceus）是我国重要的海水经济鱼类，具有重要的商品价值。很多研究表明，叁倍体鱼类除了在生长等性状方面的优势外，在生殖方面具有低育性和不育性。正是因为叁倍体鱼在生殖方面独特的不育性，近年来伴随分子生物学和基因重组技术的发展，利用转基因技术培育带有特异标记的品系，对原始生殖细胞（PGC）进行标记、分离，经过显微操作技术实现原始生殖细胞的移植，在鱼类生殖细胞移植方面不育的叁倍体可以作为理想的受体鱼。不育的叁倍体鱼在接受外源生殖细胞移植后，可以排除内源性生殖细胞的干扰。本文以牙鲆和圆斑星鲽（Veraspervariegatus）为研究对象，首先对圆斑星鲽的精子进行了冷冻保存实验，然后用静水压法诱导牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交叁倍体和四倍体，筛选了最佳诱导条件，得到生殖细胞移植需要的叁倍体。主要结果如下：1.将圆斑星鲽精子收集后，超低温冷冻保存，筛选出HBSS作为冷冻稀释液，15%DMSO作为冷冻保护剂。对解冻后的圆斑星鲽精子进行受精实验，受精率能达到（61.00±2.00）%，同时对精子激活后的运动率进行了检测，解冻后激活的精子的存活时间会显着缩短，解冻后的精子的存活时间大约为150s，激活后的新鲜精子存活时间大约为250s。经过冷冻后的精子其形态特征会受到损伤，其生理活性也会下降。2.本研究利用牙鲆（♀）和圆斑星鲽（♂）的配子受精后，用静水压法抑制受精卵第二极体的排出，诱导杂交叁倍体。并筛选出最佳的诱导条件。实验证明，静水压法可以诱导出牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交叁倍体，诱导率主要受到受精后处理起始时刻、处理压强和压强处理时间叁个因素的影响。静水压法的最佳诱导条件为：在海水温度为15℃±0.2℃时，受精后3min起，以70MPa压力处理6min，此时相对孵化率为（24.06±1.10）%，利用倍性分析仪对其进行倍性鉴定，叁倍体率为（26.67±6.67）%。染色体分析表明，叁倍体胚胎的染色体数目为71条，对照组二倍体胚胎的染色体数目为47条。还发现了少量染色体数目为24条的单倍体胚胎。3.本研究还利用牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交后的受精卵，用静水压法抑制第一次卵裂进行杂交四倍体的诱导，实验结果表明，用静水压法在在海水温度为15℃±0.2℃时，在（P，65MPa；D，6min；TA，100-110min）可以诱导出牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）的杂交四倍体。但是在诱导过程中，胚胎发育到原肠期时会大量死亡，孵化率非常低。染色体观察发现，除了能诱导出四倍体外，在胚胎中还发现有嵌合体的存在。
陈亚坤[9]2010年在《超低温保存对真鲷（Pagrus major）精子质量的影响》文中研究说明一般认为,在超低温条件下精子处于休眠状态,代谢活动基本停止,长时间保存对精子的质量没有显着影响。然而随着超低温保存技术的广泛应用和精子质量检测方法的发展和完善,有文献报道,在液氮超低温条件下保存的精子质量发生了变化。本论文以冷冻精子库中保存1个月到84个月的真鲷(Pagrus major)精子为研究对象,通过对冷冻精子寿命、运动率、受精率、孵化率和超微结构的观察、对冷冻精子超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)等酶活性的测定、以及对冷冻精子核DNA损伤的检测,系统研究了冷冻保存对精子的结构、生理功能、生化组成和遗传物质等特征的影响,从不同层面揭示精子在超低温保存过程中的结构及功能变化规律,以期阐明长期冷冻保存对鱼类精子质量的影响及影响机理。主要研究结果如下:1.测定液氮保存2,12,25,37,60,84个月的真鲷精子的运动率、受精率和孵化率,结果表明,冷冻精子的运动率、受精率、孵化率随保存时间的延长显着下降(P<0.05)。保存2个月的精子运动率、受精率和孵化率最高,分别为85.00%±2.00%,79.01%±12.86%,71.61%±3.26%;保存12,25,37个月的精子运动率、受精率和孵化率与保存2个月的精子差异不显着;保存60个月的精子运动率(68.00%±2.00%)、受精率(32.90%±5.29%)和孵化率(36.03%±8.59%)显着低于保存2,12,25,37个月的精子(P<0.05);保存84个月的精子运动率、受精率和孵化率最低,分别为45.00%±2.00%,16.74%±3.00%,11.22%±2.71%。2.在液氮中保存1,13,26,48,73个月的真鲷精子,解冻激活后,其持续运动时间随保存时间的延长而降低,持续运动时间分别为180s,180s,150s,140s,100s;冷冻精子在4℃的存活寿命分别为120h,38h,38h,28h,20h。另外,保存1,13,26个月的精子加入海水后立即激活达到最高运动率,而保存48和73个月的精子加入海水后开始的10-20s约只有10%的精子运动,随后运动精子陆续增多,经过50-60s才达到最高运动率。3.真鲷冻精超微结构观察结果表明,正常精子呈近似圆球形,直径为1.3-1.4μm,包括头部,中段和尾部叁部分结构,其中头部和中段紧密相接,冷冻精子损伤主要表现为精子头部损伤,线粒体损伤以及精子质膜、核膜的损伤,其中膜损伤为主要损伤,损伤精子中80%-90%带有膜损伤。4.对液氮中保存1,13,26,48,73个月的真鲷精子解冻后进行酶活性测定,结果表明,保存1和13个月的精子SOD活性差异不显着,保存48和73个月的精子SOD活性显着低于保存1和13个月的精子(P<0.05),保存26个月和保存1,13,48,73个月的精子之间SOD活性无显着差异;保存1个月的精子CAT活性最高,显着高于保存13,26,48,73个月的精子(P<0.05),保存13,26,48,73个月的精子之间CAT活性无显着差异;保存13个月的精子LDH活性最高(1817.22±431.41 u/mgprot),显着高于其他组精子(P<0.05);保存73个月的精子SDH活性最高(31.90±2.87 u/mgprot),保存1个月的精子SDH活性最低(18.83±1.34 u/mgprot)。5.对液氮中冷冻保存11,23,36,58,83个月的真鲷精子进行单细胞凝胶电泳实验,结果表明,冻精彗星率为34.00%±4.00%～42.67%±9.45%,鲜精彗星率为30.67%±6.43%,各组冻精和鲜精之间彗星率差异不显着,即保存11-83个月的冻精和鲜精之间遗传物质稳定性差异不显着(P>0.05)。本研究表明,超低温保存对精子质量存在显着的影响,长期冷冻保存主要影响精子的寿命、运动率、受精率、孵化率、抗氧化酶活性等参数,上述参数都随保存时间延长呈下降趋势。
程顺, 闫家强, 竺俊全, 吴雄飞[10]2013年在《甘油为抗冻剂超低温冷冻保存大黄鱼精子的DNA损伤》文中研究说明以甘油(Gly)为抗冻剂、0.5 mL麦细管为冻存管,两步降温法超低温冷冻保存大黄鱼精子,用单细胞凝胶电泳(SCGE)法检测冻精核的DNA损伤。结果表明:以Cortland液为稀释溶液,5%~20%Gly为抗冻剂,超低温冷冻保存大黄鱼精子的效果较佳,冻精活力与鲜精活力无显着差异;Gly浓度为10%,冻精的激活率和运动时间分别达89.93%和8.91min;25%、30%Gly组冻精活力显着下降;SCGE检测显示,Gly浓度5%~20%时,冻精核DNA损伤与鲜精无显着差异,Gly浓度25%及30%时,冻精核DNA损伤与鲜精差异显着;鲜精与冻精的DNA损伤主要表现为轻度和中度损伤,重度损伤比率较低,完全损伤只存在于25%Gly及30%Gly组的冻精中,且比例低。
参考文献：
[1]. 大黄鱼精子和胚胎的超低温保存研究[D]. 陈雄芳. 中国海洋大学. 2004
[2]. 鞍带石斑鱼精子低温保存研究[D]. 陈亚敏. 广东海洋大学. 2013
[3]. 点带石斑鱼精子种质保存研究[D]. 王小刚. 海南大学. 2010
[4]. 几种海洋经济动物种质资源超低温冷冻保存研究[D]. 韩龙江. 中国海洋大学. 2015
[5]. 超低温冷冻保存对大黄鱼精子酶活性的影响[J]. 黄晓荣, 章龙珍, 庄平, 刘鉴毅, 张涛. 海洋渔业. 2012
[6]. 花鲈仔鱼发育与精液低温冷冻保存研究[D]. 柴森浩. 中国海洋大学. 2014
[7]. 几种海水鱼类种质超低温冷冻保存研究[D]. 姜静. 上海海洋大学. 2014
[8]. 牙鲆和圆斑星鲽杂交叁倍体诱导的初步研究[D]. 刘金相. 中国海洋大学. 2013
[9]. 超低温保存对真鲷（Pagrus major）精子质量的影响[D]. 陈亚坤. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2010
[10]. 甘油为抗冻剂超低温冷冻保存大黄鱼精子的DNA损伤[J]. 程顺, 闫家强, 竺俊全, 吴雄飞. 中国畜牧杂志. 2013