一、细胞周期调控与骨肉瘤（论文文献综述）
蔡启轩[1]（2021）在《长链非编码RNA LINC01614通过miR-520a-3p/SNX3调控轴促进骨肉瘤进展的分子机制》文中提出骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发恶性骨肿瘤,侵袭性强且易早期转移,以至于患者病程快、预后差,往往造成致命的威胁。尽管近些年肿瘤的治疗手段有了长足的提升,但因骨肉瘤复杂的致病机制难以被攻破,治疗效果很难实现突破性的进展。因此深入探究骨肉瘤致病的分子机制,寻找骨肉瘤中关键的功能分子对骨肉瘤的早期诊断及有效治疗具有极其重要的意义。长链非编码RNA（Lnc RNAs）是构成非蛋白质编码RNA的一类大分子。Lnc RNAs可以通过与不同分子的相互作用,参与多种细胞生物过程（信号、诱饵、引导、支架）。另外lnc RNAs不仅在调节一些正常的生理过程中发挥作用,还参与调控肿瘤的发生、发展及远处转移等,一些lnc RNAs已被证实可以作为生物标志物（预后指标、治疗靶点）,甚至可以调节患者对化疗药物的敏感性。目前已经证明了lnc RNAs在骨肉瘤的发生发展中起到重要的调控功能,因此,继续探寻尚未“解锁”的lnc RNAs,系统多维地探究lnc RNAs在骨肉瘤中扮演的角色,筛选具有关键作用的lnc RNAs,深入挖掘其在骨肉瘤中具体的调控作用,不仅有助于发现骨肉瘤相关的致病机制,还可以为骨肉瘤的精准治疗提供理论基础,为医疗的发展做出贡献。本研究中通过对骨肉瘤癌及癌旁组织样本进行全转录组测序分析,检测差异表达的lnc RNAs、miRNAs及m RNAs分子表达谱数据,运用计算生物学研究方法,获取三种差异基因之间的分子调控网络数据,通过GO功能注释及KEGG代谢通路分析,对差异lnc RNAs/miRNAs/m RNAs共调控网络的靶基因及筛选出的核心lnc RNAs的靶基因进行功能分析,并通过细胞学及组织学对LINC01614（核心lnc RNAs）进行验证。验证无误后,对其调控骨肉瘤的生物学功能（增殖、迁移、侵袭、凋亡等）进行实验探究,结合LINC01614/miR-520a-3p/SNX3三者之间的调控关系,进一步对该调控轴进行验证并确定其在骨肉瘤中的调控功能,从而明确LINC01614可以通过miR-520a-3p/SNX3调控轴促进骨肉瘤进展的机制。第一部分骨肉瘤中以lnc RNAs为核心的调控网络构建及关键基因的筛选我们利用三组骨肉瘤癌及癌旁组织样本进行全转录组测序以获取其分子表达谱数据,通过对比分析共筛选得到163个差异表达lnc RNAs（67个上调表达,96个下调表达）,207个差异表达miRNAs（92个上调表达,115个下调表达）及4247个差异表达m RNAs（2019个上调表达,2228个下调表达）。综合应用LNCipedia、DAVID、STRING等多种数据库,结合生物信息统计学分析方法,获取lnc RNAs/miRNAs/m RNAs共调控网络关系并对差异表达lnc RANs的靶基因进行功能分析,发现骨肉瘤中差异表达lnc RNAs可能具有调控骨细胞分化、蛋白结合和生物大分子合成的功能,并可能参与了PI3K-Akt、AMPK等与肿瘤发生发展密切相关的代谢通路。另外我们通过差异表达显着情况选取了LINC01614、MALAT1两种lnc RNAs,分别构建了以两者为核心的lnc RNAs/miRNAs/m RNAs调控网络,并对调控网络中的靶基因进行了功能分析及蛋白互作网络分析,发现LINC01614的靶基因可能参与调控Wnt信号通路、细胞迁移等致癌生物学过程;MALAT1的靶基因可能参与了调控成骨分化、蛋白质转运等生物学过程。我们进一步利用骨肉瘤细胞和正常成骨细胞及骨肉瘤癌和癌旁组织标本对选取的这两种lnc RNAs的表达情况进行了q RT-PCR检测,发现两者在多种骨肉瘤细胞及骨肉瘤癌组织中均呈现高表达,这与我们之前生信分析的结果一致,同时也为我们进一步深入挖掘lnc RNAs在骨肉瘤中的调控功能及相关分子机制提供了方向。第二部分LINC01614在骨肉瘤中的调控功能研究通过第一部分的分析及验证,我们选取了LINC01614为本研究的突破口,旨在探究其在骨肉瘤中的相关调控功能。首先我们利用从“TARGET”数据库获得的骨肉瘤患者的临床数据进行了生存分析研究,发现LINC01614与患者生存率呈负相关,且与骨肉瘤病理分期呈正相关,提示了LINC01614可能在骨肉瘤的发生发展中起到不利作用。接下来体外实验,通过CCK-8实验检测细胞增殖情况,结果提示沉默LINC01614可以明显抑制骨肉瘤细胞的增殖能力;通过transwell细胞侵袭实验和细胞划痕实验检测细胞侵袭及迁移能力,发现沉默LINC01614可以抑制骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力;通过Western Blot检测沉默LINC01614骨肉瘤细胞内的PCNA、caspase-3以及E-cadherin的蛋白表达情况,再次验证沉默LINC01614可抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭及迁移能力,并提示LINC01614可能与骨肉瘤细胞凋亡有关;通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况,发现沉默LINC01614可以促进骨肉瘤细胞的凋亡。体内实验中,通过小鼠移植瘤实验,发现沉默LINC01614可以有效降低骨肉瘤在体内的成瘤速度及体积。总而言之,体内与体外实验均可证明LINC01614具有促进骨肉瘤进展的作用。第三部分LINC01614调控骨肉瘤发生发展的分子机制研究通过对第一部分中LINC01614调控网络的分析,结合第二部分LINC01614在骨肉瘤中的调控作用,我们提出了LINC01614可能通过miR-520a-3p/SNX3调控轴来促进骨肉瘤进展的假设。接下来,我们通过q RT-PCR及Western Blot等实验对三者结合关系进行了验证;并应用生物信息学数据库预测miR-520a-3p与LINC01614以及miR-520a-3p与SNX3的结合位点,再通过荧光素酶报告基因实验对结合位点进行了验证;在此基础上,我们又补充了Ago2 RIP实验进一步验证三者结合方式,结果提示LINC01614可通过竞争性结合miR-520a-3p来调控SNX3的表达。而后通过对沉默和过表达miR-520a-3p、沉默SNX3以及各自空白对照的骨肉瘤细胞进行CCK8细胞增殖实验、transwell细胞侵袭实验、细胞划痕实验以及流式细胞凋亡实验,实验结果提示miR-520a-3p、SNX3可影响骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及凋亡过程;再通过对共转染miR-520a-3pinhibitor+sh RNA-NC、miR-520a-3p-inhibitor+sh RNA-LINC01614及miR-520a-3pinhibitor+sh RNA-SNX3等多组细胞进行CCK8细胞增殖实验、transwell细胞侵袭实验、细胞划痕实验以及流式细胞凋亡实验,发现LINC01614及SNX3均可影响miR-520a-3p对骨肉瘤细胞功能的调控作用,结果提示LINC01614可通过竞争性结合miR-520a-3p来调控SNX3的表达,从而对骨肉瘤的发生发展起到一定的调控作用。最后,我们通过Western Blot检测沉默LINC01614、沉默SNX3、沉默及过表达miR-520a-3p骨肉瘤细胞内的β-catenin及Wnt1蛋白表达情况,结果提示LINC01614/miR-520a-3p/SNX3调控骨肉瘤的生物功能有可能与其参与调控Wnt信号通路相关,这也为今后的研究提供了一定思路。
刘媛[2]（2021）在《长链非编码RNA参与骨肉瘤和胃癌增殖、迁移与耐药的机制研究》文中研究说明背景:恶性肿瘤是严重危害我国居民生命健康的主要慢性疾病。根据组织来源的不同,将上皮组织来源的恶性肿瘤统称为癌,而间叶组织来源的则统称为肉瘤,其中骨肉瘤是最常见的间叶组织恶性肿瘤,胃癌则是常见的腺癌。无论是骨肉瘤还是胃癌,探究其发病原因及机制,找到新的治疗靶点和生物标志物,仍是目前研究亟需解决的问题,从而为临床诊断和治疗提供了新的思路和理论基础。lncRNA是一种非编码的RNA转录物,它涉及调控多种机制,包括转录,翻译,蛋白质修饰以及某些信号通路,其中lncRNA可以作为miRNA的海绵,进而调节miRNA的水平和下游基因表达,发挥重要病理生理作用。LBX2-AS1是新近在食管鳞状上皮癌发现的一种促癌lncRNA,作为ceRNA调控靶基因的表达,且能促进胃癌、肝癌、卵巢癌、神经胶质瘤等多种肿瘤的发展和进程[1-6],但在骨肉瘤中作用却没有报道;LncRNA TUG1则在肺癌[7]、卵巢癌[8]、胰腺癌[9]等多种肿瘤中高表达,还参与调控细胞增殖、凋亡和EMT信号通路,但TUG1在胃癌中的作用还尚不清楚。本文选定恶性肿瘤两种不同组织来源的典型病理类型骨肉瘤及胃癌作为研究对象,探索lncRNAs参与骨肉瘤和胃癌的发生发展。第一部分:长链非编码RNA LBX2-AS1通过LBX2-AS1/miR-5010-5p/WNT7B轴促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移目的:（1）阐明LBX2-AS1在骨肉瘤细胞中的表达水平并探究是否参与调控骨肉瘤的增殖和迁移。（2）阐明LBX2-AS1是否通过作为ceRNA竞争性吸附miR-5010-5p调控下游WNT7B表达,进而影响骨肉瘤的生物学功能。方法:首先培养人成骨细胞h FOB1.19和骨肉瘤Saos-2,143b细胞,通过荧光定量PCR检测LBX2-AS1在成骨细胞和骨肉瘤细胞的表达水平,然后在Saos-2与143b细胞中转染si-LBX2-AS1构建LBX2-AS1低表达细胞株,采用RT-PCR检测si-LBX2-AS1在细胞中的转染效率,通过CCK8实验、划痕实验和Transwell实验检测LBX2-AS1低表达细胞株增殖、迁移及侵袭能力。通过直接结合种子序列预测的方法预测LBX2-AS1调控的miRNA以及下游靶基因,通过荧光素酶报告、Western bolt和RT-PCR验证了LBX2-AS1与miR-5010-5p和WNT7B的关系。采用恢复实验分析LBX2-AS1和miR-5010-5p同时沉默对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果:（1）荧光定量PCR的结果显示,与成骨细胞相比,LBX2-AS1在骨肉瘤细胞中的表达水平显着升高。（2）RT-PCR结果表明,对照组LBX2-AS1的表达量是转染si-LBX2-AS1骨肉瘤细胞株的3倍（p<0.05）,LBX2-AS1低表达细胞株构建成功。（3）CCK-8、划痕实验和Transwell实验结果验证了LBX2-AS1促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移。（4）预测结果显示miR-5010-5p可能是LBX2-AS1调控的miRNA,而WNT7B则是被调控的下游靶基因,荧光素酶报告实验结果显示miR-5010-5p分别与LBX2-AS1（WT）和WNT7B（WT）共转染可以影响荧光素酶的强度,证明了LBX2-AS1可以与miR-5010-5p结合,而WNT7B则是miR-5010-5p的靶标,Western bolt和RT-qPCR结果验证了LBX2-AS1作为ceRNA吸附miR-5010-5p上调WNT7B。（5）CCK-8、划痕和迁移实验结果证明,在LBX2-AS1低表达细胞中沉默miR-5010-5p,因沉默LBX2-AS1而抑制的增殖和迁移可以被恢复,即LBX2-AS1通过调控miR-5010-5p/WNT7B轴促进骨肉瘤细胞增殖和迁移。结论:（1）LBX2-AS1在骨肉瘤中高表达并促进骨肉瘤的增殖和迁移。（2）LBX2-AS1作为ceRNA通过调控miR-5010-5p/WNT7B轴促进骨肉瘤进展。第二部分:TUG1在胃癌中作用的生物信息学分析及实验验证目的:（1）生物信息学分析TUG1在胃腺癌中的表达水平、与临床特征的相关性以及诊断价值。（2）生物信息学分析TUG1在胃腺癌中的潜在作用。（3）实验初步验证TUG1对胃癌多药耐药,迁移,侵袭的影响。方法:（1）下载TCGA数据库中胃腺癌相关的临床数据和RNAseq数据,分析TUG1在配对和非配对的正常组织和癌组织中的表达。（2）使用TCGA数据库中胃腺癌相关临床数据分析TUG1表达与临床特征之间的相关性。（3）使用KM plotter数据库分析TUG1对胃腺癌患者总生存率OS（n=881）、首次进展时间FP（n=645）、和无疾病进展时间PFS（n=503）的影响。（4）使用TCGA数据库中胃腺癌相关的临床数据和RNAseq数据分析TUG1在胃腺癌中的诊断价值。（5）分析TCGA数据库胃腺癌中TUG1的共表达基因,对其进行GO/KEGG富集分析。（6）将TCGA数据库中胃腺癌相关RNAseq数据按照TUG1的高低表达进行分组,GSEA分析TUG1相关的生物学过程和信号通路。（7）免疫组化验证TUG1在胃癌组织切片中的表达,同时分析其与临床病理特征的相关性及生存分析。（8）RT-PCR比较TUG1在胃癌细胞株及耐药细胞株的表达差异;（9）构建稳转的TUG1过表达的胃癌细胞株和沉默的耐药细胞株,通过流式细胞术和RT-PCR检测转染成功与否;（10）通过CCK-8、划痕和迁移实验检测TUG1过表达及沉默对胃癌细胞的增殖、迁移和耐药的影响。结果:（1）胃腺癌组织中的TUG1基因表达水平在配对样本和非配对样本中均显着高于正常组织。（2）TUG1的高表达与年龄（p=0.044）,抗反流治疗（p=0.001）,疾病特异性生存率（p=0.038）显着相关。（3）TUG1高表达与不良的总生存率,无进展生存率和首次进展率相关。（4）GO/KEGG富集分析结果表示TUG1参与调控细胞周期和DNA复制相关通路。（5）GSEA分析表示TUG1参与增殖的正向调节,底物依赖性细胞迁移以及凋亡执行阶段的调节。（6）RT-PCR结果显示TUG1在胃癌耐药株中表达高于胃癌细胞株。（7）TUG1过表达的胃癌细胞株及沉默的耐药细胞株构建成功。（8）CCK-8、划痕和迁移实验结果表明TUG1促进胃癌细胞的耐药、迁移和侵袭。结论:（1）生物信息学分析TUG1在胃腺癌中可以作为诊断的分子标志物,并参与调控增殖,迁移以及DNA复制相关通路（2）实验验证结果表明TUG1上调促进了细胞增殖和迁移进而增加胃癌耐药。
刘光平[3]（2021）在《TIPE1介导PRMT1调控STAT3精氨酸甲基化修饰参与骨肉瘤增殖机制研究》文中研究说明【研究目的】骨肉瘤是一种起源于骨骼系统的恶性原发性肿瘤,其发病年龄多见于青少年和中青年人群,骨肉瘤发生的原因目前不明,主流的观点认为其主要与患者本身的基因缺陷、病毒感染及电离辐射等因素相关,最终导致骨骼系统产生不成熟的骨质或者类骨质成份。骨肉瘤恶性程度较高,容易发生远处转移（主要为肺部转移）,因此预后较差。尽管目前临床上施行手术、化疗、靶向治疗等综合治疗手段可以使骨肉瘤患者的生存率得到极大的提升,但国内骨肉瘤复发病人5年生存率仅20%左右,因此寻找有效治疗靶点、发现早期诊断标志物以及阐明其发病机制至关重要。TIPE基因家族由4个成员组成（包括TIPE、TIPE1、TIPE2和TIPE3）,该基因家族与机体免疫调节和肿瘤发生密切相关。尽管四个成员之间具有显着的序列同源性,但它们参与了不同的细胞生物学活动调节过程。研究发现TIPE1在肝癌、乳腺癌等肿瘤类型中主要行使抑癌基因功能,课题组曾首次阐明TIPE1促进了宫颈癌及鼻咽癌的恶性生物学行为,但它在骨肉瘤中的生物学作用目前尚不清楚。本课题利用临床标本、细胞、动物模型及多种分子生物学技术,系统揭示TIPE1如何精准调控PRMT1活性,以及如何通过蛋白精氨酸甲基化修饰方式调控STAT3精氨酸位点甲基化水平参与骨肉瘤增殖的详细过程。本课题的完成不仅阐明了TIPE1在骨肉瘤发生中的新型分子机制,并可为骨肉瘤临床诊断及预后提供潜在的肿瘤分子标志物。【研究方法】一、TIPE1对骨肉瘤细胞增殖能力的影响。1.细胞模型:为明确TIPE1对骨肉瘤细胞增殖水平是否有影响,我们在TIPE1表达较低的骨肉瘤细胞系MNNG/HOS CL#5过表达TIPE1,在TIPE1表达较高的骨肉瘤细胞系MG63转染TIPE1干扰慢病毒,利用CCK8、克隆形成等实验观测细胞增殖指标,通过流式细胞仪PI染色技术检测细胞周期改变情况。2.裸鼠成瘤实验:选择4-6周龄BALB/c裸鼠,将过表达TIPE1的骨肉瘤细胞系MNNG/HOS CL#5及对照细胞种植于裸鼠腋窝处皮下,进行裸鼠成瘤实验,待瘤体直径至0.5cm大小时,比较肿瘤生长速率、肿瘤体积变化。二、TIPE1通过调控PRMT1/STAT3通路调控骨肉瘤增殖的分子机制。1.TIPE1通过与PRMT1直接结合调控STAT3通路。（1）转录组芯片及基于IPA的经典通路分析:过表达TIPE1及对照的骨肉瘤细胞系MNNG/HOS CL#5,经过准备poly-A RNA controls→合成第一链cDNA→合成第二链cDNA→通过体外转录合成标记cRNA→cRNA纯化及定量-→cRNA片段标记→杂交等步骤,得到芯片数据,最后通过基于IPA的经典通路分析,发现TIPE1在骨肉瘤中调控的关键通路STAT3;利用实时荧光定量PCR技术进行进一步验证。（2）利用Co-IP-MS等技术,初步确立TIPE1通过PRMT1调控下游分子STAT3的逻辑关系:首先构建用于Co-IP-MS技术的特殊TIPE1载体,在骨肉瘤细胞系中过表达,最后通过Co-IP→质谱分析→基于定量蛋白质组学的生信分析→Co-IP、Duolink等技术进一步验证,初步明确TIPE1通过与PRMT1直接结合,调控下游分子STAT3的确切分子机制。（3）干扰PRMT1,过表达TIPE1后Western Blot检测STAT3蛋白的表达变化,CCK8测生长曲线观测TIPE1对骨肉瘤增殖抑制现象的逆转,进一步明确TIPE1-PRMT1-STAT3的调控逻辑关系。2.PRMT1系列截短序列的构建及TIPE1与PRMT1相互作用位点的确定。根据PRMT1蛋白结构域,构建系列截短序列,在HEK293T细胞中共转染TIPE1-Flag和PRMT1-HA全长或不同缺失片段的表达载体,用Co-IP方法确定TIPE1蛋白与PRMT1相互作用的特定位点。3.TIPE1通过抑制PRMT1精氨酸甲基转移酶活性抑制STAT3甲基化水平。（1）利用精氨酸单甲基化修饰定量蛋白质组学技术,通过蛋白提取→蛋白酶解→MMA（精氨酸单甲基化）富集→质谱检测→信息分析等流程,鉴定TIPE1对骨肉瘤细胞系中精氨酸单甲基化修饰程度,以及STAT3蛋白精氨酸单甲基化修饰情况。（2）TIPE1抑制PRMT1对相关底物蛋白STAT3甲基化水平的验证:由于缺乏STAT3甲基化抗体,各组都首先转染STAT3-His,利用His抗体进行免疫共沉淀富集STAT3蛋白,最后利用通用型甲基化抗体检测STAT3甲基化水平。将TIPE1-Flag转染到HEK293T细胞中,检测在细胞正常生理条件下,TIPE1是否以剂量依赖方式调控内源PRMT1对其底物STAT3的甲基化能力。利用siRNA技术,将TIPE1-sh转染到HEK293T细胞中,抑制内源TIPE1的表达后,检测内源PRMT1对STAT3的甲基化水平影响;过表达TIPE1的HEK293T细胞中抑制内源PRMT1的表达后,检测PRMT1底物的甲基化水平。4.TIPE1抑制STAT3的转录水平。在HEK293T细胞中共转染pGL3-promoter vector 或者APRE luciferase reportorgene,以及PRMT1-HA、TIPE1-Flag、STAT3-His载体,在IL-6的刺激下,利用双荧光素酶活性测定发现TIPE1对PRMT1调控的下游基因STAT3的转录激活能力。三、临床标本验证TIPE1通过PRMT1/STAT3通路参与骨肉瘤发生。利用组织芯片,验证肿瘤组织中TIPE1表达水平与肿瘤分期的关系;分析TCGA数据库肿瘤组织中TIPE 1的表达与STAT3表达的相关性。【实验结果】一、TIPE1抑制骨肉瘤细胞增殖能力。1.体外实验。本研究结果显示TIPE1可明显抑制两种骨肉瘤细胞系的增殖速度,细胞周期结果提示TIPE1也显着降低骨肉瘤细胞周期S期比值,另外TIPE1可使骨肉瘤细胞克隆形成能力明显减弱。2.体内实验。本研究结果提示TIPE1可显着抑制骨肉瘤细胞裸鼠成瘤能力,进一步的免疫组化结果表明TIPE1可抑制细胞增殖指标Ki67的表达水平。二、TIPE1介导PRMT1调控STAT3精氨酸甲基化修饰参与骨肉瘤增殖的分子机制。1.TIPE1通过与PRMT1直接结合调控STAT3通路。前期结果提示TIPE1可以抑制骨肉瘤细胞增殖,为进一步明确其中机制,课题组利用转录组芯片及基于IPA的经典通路分析,结果提示TIPE1在骨肉瘤细胞系MNNG/HOS CL#5中主要抑制STAT3通路,qPCR验证结果也显示过表达TIPE1后STAT3表达明显降低。那么,TIPE1在骨肉瘤中抑制STAT3通路的机制到底如何?带着上述疑问,课题组利用Co-IP-MS等技术,发现TIPE1可能通过与PRMT1相互作用发挥生物学功能。基于STAT3蛋白是PRMT1的已知调控底物,因此我们认为TIPE1通过抑制PRMT1的功能,继而影响了 STAT3的表达。继而,我们利用挽救实验对PRMT1进行干扰后,发现可逆转过表达TIPE1导致的STAT3抑制现象,且骨肉瘤细胞增殖被TIPE1抑制的现象也明显得以逆转。以上结果表明TIPE1可能通过PRMT1抑制了 STAT3通路。2.PRMT1系列截短序列的构建及TIPE1与PRMT1相互作用位点的确定。课题组构建了系列截短PRMT1序列,通过Co-IP实验发现TIPE1蛋白主要与PRMT1的催化区域结合。3.TIPE1通过抑制PRMT1精氨酸甲基转移酶活性抑制STAT3甲基化水平。TIPE1究竟通过哪种方式来抑制PRMT1的甲基转移能力是课题组的主要研究内容之一,已有研究发现PRMT1甲基化酶催化区和同源二聚化区是其发挥甲基化酶活性最关键的结构域。基于上述结果发现TIPE1主要与PRMT1催化区域结合,我们认为TIPE1可能影响了 PRMT1的甲基化酶活性。因此,利用精氨酸单甲基化修饰定量蛋白质组学技术发现TIPE1可下调STAT3精氨酸位点甲基化水平。进一步分析发现过表达TIPE1以浓度依赖方式抑制内源PRMT1介导的STAT3甲基化,干扰TIPE1则促进内源PRMT1介导的STAT3甲基化。4.TIPE1抑制STAT3的转录水平。利用双荧光素酶活性实验发现TIPE1抑制PRMT1调控的下游基因STAT3的转录能力。我们的结果发现TIPE1可显着抑制PRMT1介导的STAT3转录水平,该结果进一步提示TIPE1通过抑制PRMT1底物STAT3甲基化水平,将最终导致STAT3转录水平的下调。三、临床标本验证TIPE1抑制STAT3通路参与骨肉瘤发生。利用组织芯片,发现肿瘤组织中TIPE1表达水平与骨肉瘤肿瘤分期负相关,TCGA数据库显示肉瘤组织中TIPE1的表达与STAT3表达也具有负相关性。该结果在临床上进一步证实了 TIPE1负调控STAT3的现象。【结论】虽然文献报道了 PRMT1及STAT3在肿瘤中的重要生物学功能,并初步阐述了PRMT1调控STAT3的相关机制,但是TIPE1如何调控PRMT1及相关下游信号通路尚不明确。本课题的完成阐明了TIPE1精准调控PRMT1活性的方式,明确了TIPE1通过调控PRMT1活性,继而影响下游分子STAT3表达的确切分子机制,最终对骨肉瘤细胞增殖起明显抑制作用。本课题的完成将为骨肉瘤患者的临床诊疗提供了新的靶点和治疗策略,同时为骨肉瘤预后预测及早期诊断标志物的发现提供理论与实践可能。
杨炳生[4]（2021）在《环状RNAcirc＿001422通过调节miR-195-5p/FGF2/P13K/Akt信号轴促进骨肉瘤增殖与转移》文中研究说明研究背景与目的骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,好发于儿童和青少年,具有快速浸润性生长、早期肺转移和高复发率等特征。局限性骨肉瘤患者的五年总体生存率为65%-75%,而复发性或转移性骨肉瘤患者的五年总体生存率仅为20%。目前,骨肉瘤仍缺乏特异性的诊断和治疗靶点,迫切需要开展更多的分子研究以寻找具有应用前景的生物标志物。环状RNA（circular RNA,circRNA）广泛表达于真核生物,通过海绵吸附微小RNA（microRNA,miRNA）、与RNA结合蛋白互相作用以及调节靶基因的表观遗传学、转录或翻译修饰等途径介导多种生理和病理过程。环状RNA的异常表达与多种癌症的发病密切相关。由于其具有结构稳定、进化保守、表达丰富和组织特异性等特点,被认为是潜在的理想生物标志物。然而,迄今为止,环状RNA在骨肉瘤恶性进程中的具体作用仍不清楚。本课题拟探讨环状RNA对骨肉瘤细胞增殖和转移能力的作用及其分子机制,旨在为骨肉瘤的分子靶向治疗提供新的思路。研究方法1.Circ001422的鉴定及临床相关性分析（1）高通量转录组测序筛选差异表达的circRNA,利用qRT-PCR检测circ001422在骨肉瘤组织和细胞系中的表达量;（2）RNase R耐受和放线菌素D实验检测circ001422的稳定性;（3）核浆分离实验和荧光原位杂交技术检测circ001422的胞内定位;（4）qRT-PCR分析circ001422与骨肉瘤患者的肿瘤分期、大小、转移、原发肿瘤位置、生存预后等临床特征的相关性。2.Circ001422对骨肉瘤细胞生物学行为的影响（1）EdU摄取实验、平板克隆实验、流式细胞术、Transwell实验和Western blot检测circ001422对骨肉瘤细胞体外增殖与转移能力的影响;（2）裸鼠皮下成瘤和尾静脉注射肺转移模型观察circ001422对骨肉瘤细胞体内增殖与转移能力的影响。3.Circ001422促进骨肉瘤细胞增殖与转移的机制（1）RIP实验、生物信息学分析、RNA pull-down实验、mRNA测序和双荧光素酶报告基因实验筛选circ001422的下游miRNA和mRNA分子;（2）功能挽救实验检测circ001422/miR-195-5p/FGF2信号轴对骨肉瘤细胞恶性生物学行为的作用。研究结果1.Circ001422在骨肉瘤癌组织和细胞中表达上调,具有稳定的环状结构,主要定位于细胞质;2.高表达水平的circ001422与肿瘤分期、大小、远处转移及不良预后均呈正相关;3.体外实验中,circ001422能促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭,同时抑制细胞周期阻滞和细胞凋亡;体内实验中,circ001422能促进裸鼠皮下移植瘤生长和肺转移;4.Circ001422通过miR-195-5p/FGF2/PI3K/Akt信号轴在骨肉瘤中发挥促癌作用。研究结论Circ001422通过海绵吸附miR-195-5p,促进下游FGF2表达和激活PI3K/Akt信号通路,从而增强骨肉瘤细胞的体内外增殖与转移能力,提示circ001422可能是骨肉瘤治疗的潜在作用靶点。
梁远[5]（2021）在《甘草查尔酮A通过氧化应激与内质网应激抑制骨肉瘤的机制研究》文中指出骨肉瘤（Osteosarcoma）,一种由间充质干细胞分化异常所引起的疾病,是好发于10岁-20岁儿童及青少年中最为常见的原发性骨恶性肿瘤。骨肉瘤具有高度恶性,不仅生长迅速,而且15-20%的患者在首次就诊时就被发现存在远处转移病灶,预后较差,给患者及其家庭带来巨大的痛苦。目前抗癌药物副作用较大,且容易形成多药耐药,而多药耐药往往是骨肉瘤治疗失败的重要原因。因此,寻找一种新型有效、安全的药物,提高骨肉瘤的治疗效果,是目前亟需解决的关键问题。甘草查尔酮A（Licochalcone A,LCA）,从中国经典的中草药甘草中提取的化合物。既往研究指出甘草查尔酮A具有抗病毒、抗肿瘤、抗血管生成等多种生物学活性,尤其是其在抗肿瘤领域具有较高的生物活性,因此近些年受到了广泛关注。不少研究证实,甘草查尔酮A抑制肿瘤的发生发展的主要机制是抑制肿瘤细胞的增殖、阻滞肿瘤细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡等。内质网（Endoplasmic reticulum,ER）,是细胞内参与钙离子的调节和蛋白质合成、加工和转运的重要细胞器,由于外在、内在因素引起内质网内蛋白折叠异常引起的内质网功能的异常称为内质网应激。既往研究指出,ROS可通过内质网激酶（PERK）、转录因子6（ATF6）、真核翻译起始因子（eif-2a）等内质网感受器蛋白及其下游信号通路激活内质网应激。相关研究表明,内质网应激的激活对肿瘤的发生发展起到了重要的作用。自噬（Autophagy）,在真核细胞中具有维持内环境稳态的作用,它可以降解细胞器及蛋白质等其他细胞内容物。此外,自噬还是内质网相关降解（endoplasmic reticulum-associated degradation,ERAD）途径的一个重要机制,同时参与内质网应激时错误折叠蛋白和蛋白聚集体的降解。目前细胞自噬被大部分学者认为是细胞的一种生存机制。但是,在一些有害因素的过度刺激下,自噬也可以诱导细胞发生死亡。通过激活内质网应激、自噬途径诱导肿瘤细胞凋亡是目前很多抗肿瘤药物的靶点。但是甘草查尔酮A抑制骨肉瘤的具体机制尚不清楚。我们拟探讨甘草查尔酮A对人骨肉瘤细胞系增殖的影响,同时进一步探究氧化应激、内质网应激及自噬在甘草查尔酮A诱导骨肉瘤细胞凋亡中的作用。最终期待甘草查尔酮A为我们临床治疗骨肉瘤的新的靶点提供有力的理论支撑。本课题主要分4章:第1章,以人的骨肉瘤细胞系为研究对象,探究甘草查尔酮A抑制骨肉瘤细胞增殖和周期阻滞的作用。第2章,探讨氧化应激在甘草查尔酮A诱导骨肉瘤细胞凋亡中的作用。第3章,探讨ROS介导内质网应激在甘草查尔酮A诱导骨肉瘤细胞凋亡及自噬中的作用。第4章,进一步研究甘草查尔酮A在裸鼠皮下异位种植模型中抑制骨肉瘤生长的作用。第1章甘草查尔酮A体外抑制骨肉瘤细胞增殖、诱导细胞周期阻滞目的:探究LCA体外对人骨肉瘤细胞的增殖能力及细胞周期的影响。方法:我们通过体外培养人骨肉瘤细胞,当培养所得的细胞其密度达到60%-80%时,采用不同浓度LCA作用24h和特定浓度（40μM）LCA作用不同时间的方式进行药物干预,通过CCK-8检测人骨肉瘤细胞的活力,并通过细胞克隆实验来进一步检测LCA对骨肉瘤细胞增殖的影响。同时,我们采用流式细胞仪检测细胞周期的变化及western blot进一步验证LCA作用后细胞周期蛋白的表达变化。结果:1.CCK-8测试结果表明,随着LCA药物浓度的上升,以及LCA作用时间的延长,骨肉瘤细胞活力不断的降低,呈现出明显的时间及浓度依赖性。2.细胞克隆实验也表明,骨肉瘤细胞经不同浓度的LCA处理后,骨肉瘤细胞的增殖受到抑制,且呈现浓度依赖性。3.LCA用于处理骨肉瘤细胞,流式细胞仪检测表明,G2/M期比例随LCA浓度增加而增高。Western blot检测细胞周期蛋白,结果表明,随着药物浓度的增加,细胞周期相关蛋白Cdc25C减少,p-Cdk1,p-Cdc25C,p21等表达增加,进一步说明不同浓度的LCA处理骨肉瘤细胞后,骨肉瘤细胞周期受到了明显的阻滞。结论:1.LCA能有效抑制骨肉瘤细胞的活力,其抑制作用具有时间及浓度依赖性。2.LCA对骨肉瘤细胞能够发挥较强的增殖抑制作用,具有明显的浓度依赖性,这表明LCA可能通过抑制骨肉瘤细胞的增殖来影响其生存能力。3.LCA可诱导骨肉瘤细胞周期阻滞,并其作用具有浓度依赖性。第2章氧化应激在甘草查尔酮A诱导骨肉瘤细胞凋亡中的作用目的:研究氧化应激在LCA诱导骨肉瘤细胞凋亡中的作用。方法:我们通过体外培养骨肉瘤细胞,当培养所得的细胞其密度达到60%-80%时,采用不同浓度LCA进行药物干预,通过流式细胞仪检测LCA对骨肉瘤细胞线粒体膜电位及细胞凋亡的影响,并通过荧光显微镜观察LCA及活性氧抑制剂NAC处理后,骨肉瘤细胞内ROS含量的变化。流式及western blot检测LCA对骨肉瘤细胞中相关凋亡蛋白表达的影响。使用活性氧抑制剂NAC进一步实验,通过流式细胞仪及western blot检测氧化应激在LCA诱导骨肉瘤细胞凋亡中的作用。结果:1.细胞线粒体膜电位结果表明,随着LCA药物浓度的上升,骨肉瘤细胞线粒体膜电位下降。2.荧光探针DCFH-DA检测结果显示,LCA处理后细胞内ROS含量增加,且具有浓度依赖性,NAC可以降低细胞内ROS水平。3.LCA用于处理骨肉瘤细胞,流式细胞仪检测表明,细胞凋亡率随LCA浓度增加而增高。而活性氧抑制剂NAC可以明显降低LCA诱导的骨肉瘤细胞的凋亡率。4.Western blot检测细胞凋亡蛋白,结果表明,随着LCA药物浓度的增加,细胞凋亡相关蛋白cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-8、cleaved-Caspase-9、cleaved-PARP表达量增多,同时线粒体蛋白Bax/Bcl-2比值上调,且这种改变具有显着时间依赖性,而活性氧抑制剂NAC可以部分逆转上述相关凋亡蛋白的表达。结论:1.LCA可以引起骨肉瘤细胞线粒体损伤,并诱导骨肉瘤细胞内ROS的增多。2.LCA可以诱导骨肉瘤细胞凋亡,并且还表现出明显的浓度和时间依赖性。3.LCA可以通过诱导ROS生成诱导骨肉瘤细胞凋亡。第3章ROS介导内质网应激在甘草查尔酮A诱导骨肉瘤细胞凋亡及自噬中的作用目的:探究ROS介导内质网应激在LCA诱导骨肉瘤细胞凋亡及自噬中的作用。方法:我们通过体外培养骨肉瘤细胞,当培养所得的细胞其密度达到60%-80%时,采用不同浓度LCA进行药物干预,通过流式细胞仪检测骨肉瘤细胞Ca2+含量的变化,采用Ca2+抑制剂2-APB进一步实验,并通过流式细胞技术来检测骨肉瘤细胞凋亡率的变化。采用western Blot检测LCA处理后骨肉瘤细胞的内质网应激相关蛋白表达变化,采用活性氧激抑制剂NAC进一步实验,再次采用western Blot检测氧化应激在LCA诱导骨肉瘤细胞内质网应激中的影响。为进一步研究内质网应激在LCA诱导骨肉瘤细胞凋亡中的影响,采用流式细胞仪检测LCA在内质网应激诱导剂TM及内质网应激抑制剂TUDCA作用下对骨肉瘤细胞凋亡的影响。Western blot检测LCA作用后自噬蛋白表达,同时采用透视电镜观察自噬小体。为了更直观的观察LCA对自噬通路的诱导,我们构建了能稳定表达mRFP-GFP-LC3的骨肉瘤细胞系进行进一步的实验,并通过激光共聚焦显微镜观察。与此同时,我们采用流式细胞技术检测了 3-MA预处理后LCA诱导的骨肉瘤细胞凋亡的变化。为了更深入的研究内质网应激在LCA诱导的骨肉瘤细胞凋亡和自噬中的作用,分别使用内质网应激抑制剂（TUDCA）及自噬抑制剂（3-MA）预处理骨肉瘤细胞,并使用了 RNA干扰的方法,检测其分别对LCA诱导骨肉瘤细胞内质网应激、凋亡、自噬的影响。采用western blot检测不同处理条件下细胞内质网应激、凋亡和自噬蛋白的表达。结果:1.随着LCA作用时间的增加,骨肉瘤细胞内Ca2+明显增多,而Ca2+抑制剂可以降低LCA诱导骨肉瘤细胞的凋亡率。2.Western blot检测细胞内质网应激相关蛋白,结果表明,随着LCA作用时间的延长,内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK、p-eif2α、ATF4、CHOP等表达增高,活性氧抑制剂NAC可以降低内质网应激相关蛋白的表达,且内质网应激诱导剂TM的作用下,骨肉瘤细胞凋亡比率明显增加。而内质网应激抑制剂TUDCA降低了 LCA对骨肉瘤细胞143B的凋亡比率。3.Western blot检测细胞自噬蛋白,结果表明LCA可诱导骨肉瘤细胞LC3-11蛋白表达显着上调,且这种效应有明显的时间依赖性。透射电镜及激光共聚焦显微镜观察进一步证明,LCA可以诱导自噬体的形成,抑制自噬可以促进骨肉瘤细胞凋亡。4.Western blot结果显示,抑制内质网应激反应可以减少LCA诱导的骨肉瘤细胞凋亡蛋白及自噬蛋白的表达。结论:1.LCA可以增加骨肉瘤细胞内Ca2+含量,而且Ca2+可以促进骨肉瘤细胞发生凋亡。2.ROS介导LCA促进骨肉瘤细胞发生内质网应激而增加骨肉瘤细胞凋亡。3.内质网应激在LCA诱导的骨肉瘤细胞凋亡和自噬效应的过程中起到了促进作用,且LCA诱导骨肉瘤细胞发生的自噬过程可发挥保护骨肉瘤细胞减少其凋亡的作用。第4章甘草查尔酮A在裸鼠皮下异位种植模型中抑制骨肉瘤生长的作用目的:探究LCA在裸鼠皮下异位种植模型中抑制骨肉瘤生长的作用。方法:选取10只BALB/c雄性裸鼠（4-6周龄,16-20g）,将用冷PBS稀释至100μl的143B细胞悬液（密度为1×107细胞/毫升）移植于裸鼠腋下。当裸鼠腋下肿瘤肉眼可见后,将它们随机分为两组,分别是对照组（DMSO组）和LCA处理组（30mg/kg/d）,每组5只。隔日给药,给药时间为15天。隔日测量裸鼠的体重和肿瘤的体积。在给药结束后,眼球采血,检测裸鼠的肝肾功能,然后处死所有裸鼠,并小心的切除裸鼠皮下的骨肉瘤组织及重要脏器（心脏、肝脏、脾脏、肺及肾脏组织）,多聚甲醛固定。H&E染色检测重要脏器的组织学变化,Ki67、TUNEL免疫荧光检测骨肉瘤组织的增殖情况。结果:1.对照组的肿瘤体积明显大于LCA处理组的肿瘤体积,而裸鼠的体重无明显差异。2.免疫荧光结果显示,LCA处理组Ki67表达低于对照组,且LCA处理组TUNEL表达高于对照组。3.LCA处理裸鼠后,肝肾功能指标及重要脏器的组织学无明显变化。结论:1.LCA可以抑制骨肉瘤荷瘤小鼠的肿瘤生长。2.LCA可以通过明显抑制体内骨肉瘤细胞的增殖,并诱导其凋亡。3.肝肾功能指标及重要脏器的组织学结果表明,LCA相对比较安全。
杜兴[6]（2021）在《辛伐他汀调控YAP介导的SOX9转录抑制骨肉瘤转移的作用及分子机制研究》文中认为背景与目的:骨肉瘤发病率高、恶性程度高、易转移,其中远处转移是导致患者疗效不佳和预后不良的重要因素。他汀类药物主要用于降血脂,近年来也被发现具有抑制肿瘤增殖及转移的作用,但目前在骨肉瘤方面的研究较少。研究报道,YAP和SOX9在骨肉瘤中均高表达,且与骨肉瘤细胞的迁移、侵袭有关。此外,课题组前期生物信息学预测发现,SOX9可能是YAP下游的靶基因。因此,本研究的目的是验证辛伐他汀是否可以通过调控YAP介导的SOX9转录抑制骨肉瘤转移,并在此基础上进一步探索辛伐他汀抑制骨肉瘤转移的相关机制,以期丰富骨肉瘤转移的研究内容和研究现状。方法:第一部分:首先检测辛伐他汀的作用靶点（HMGCR）在骨肉瘤细胞中的活性以及辛伐他汀是否能抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭;其次检测敲低SOX9后骨肉瘤细胞迁移侵袭能力的变化;然后检测辛伐他汀处理后骨肉瘤细胞SOX9的表达;最后通过双荧光素酶标记实验,检测辛伐他汀对骨肉瘤细胞SOX9启动子活性的影响。第二部分:首先对SOX9启动子区域进行分析,预测出TEAD与SOX9启动子可能的结合区域;其次通过染色质免疫共沉淀（Ch IP）对各预测结合位点进行筛选和验证;然后通过构造相应结合位点缺失的含SOX9启动子区域的双荧光素酶报告基因载体,检测其与TEAD结合后SOX9启动子活性的改变,进一步筛选出具体的结合位点;最后检测敲低YAP或TEAD后SOX9的表达。第三部分:首先检测骨肉瘤细胞中YAP磷酸化和细胞定位,以及YAP敲低后骨肉瘤细胞迁移侵袭能力的变化;其次检测辛伐他汀对YAP磷酸化和细胞定位的影响;最后通过Ch IP技术检测YAP与SOX9启动子的结合能力是否受辛伐他汀的调控。第四部分:首先检测RhoA在骨肉瘤细胞中的表达以及辛伐他汀处理后RhoA活性的变化;其次过表达RhoA后,检测辛伐他汀对YAP活性以及SOX9表达的影响;然后检测辛伐他汀对细胞骨架组装的影响;最后检测RhoA抑制剂（C3转移酶）和细胞骨架抑制剂（细胞松弛素D）处理后,骨肉瘤细胞YAP活性和SOX9的表达。第五部分:通过裸鼠尾静脉注射骨肉瘤细胞诱导肺转移的方法,评估辛伐他汀能否抑制骨肉瘤肺转移、能否延长裸鼠生存时间;此外通过免疫组化法检测裸鼠骨肉瘤肺转移结节中RhoA、YAP以及SOX9等蛋白的表达。结果:第一部分:HMGCR在骨肉瘤细胞中高表达;通过辛伐他汀下调甲羟戊酸的代谢,明显抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和EMT;骨肉瘤细胞中SOX9的高度激活状态有助于其迁移、侵袭和EMT;辛伐他汀通过甲羟戊酸途径调控骨肉瘤细胞SOX9的转录活性。第二部分:SOX9是YAP-TEAD的直接靶基因;SOX9启动子区域内的TB1位点,是TEAD与SOX9结合并调控SOX9转录活性所必须的。第三部分:骨肉瘤细胞中YAP的活性高度上调,与骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和EMT过程密切相关;辛伐他汀通过甲羟戊酸途径调控YAP的活性,进而抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭;通过下调甲羟戊酸的代谢,辛伐他汀可明显降低YAP和SOX9启动子结合。第四部分:RhoA在骨肉瘤细胞中高表达;辛伐他汀通过甲羟戊酸途径调控RhoA活性和细胞骨架的组装,进而抑制骨肉瘤细胞迁移、侵袭;辛伐他汀通过RhoA调控细胞骨架的组装,进而抑制YAP活性及下游SOX9的转录。第五部分:辛伐他汀在体内对骨肉瘤肺转移有明显的的抑制作用,主要表现为降低肺转移的发生率（20%vs.80%）及肺转移结节的数量（0.2个/只vs.1.6个/只）,延长裸鼠的生存期（P<0.05）等三个方面;RhoA、YAP以及SOX9在骨肉瘤肺转移结节中呈明显高表达状态。结论:RhoA、YAP和SOX9在骨肉瘤细胞中高度激活,促进其迁移、侵袭。辛伐他汀通过甲羟戊酸途径调节SOX9表达来调控骨肉瘤细胞的迁移和侵袭;而SOX9是YAP-TEAD的直接靶基因,辛伐他汀通过RhoA和细胞骨架调节YAP活性来调控SOX9转录。同时,辛伐他汀在体内可抑制骨肉瘤细胞肺转移。综上,辛伐他汀通过甲羟戊酸途径抑制RhoA的细胞膜定位,干扰细胞骨架组装,下调YAP活性,降低YAP靶基因SOX9转录,进而抑制骨肉瘤转移。
杨贵[7]（2021）在《RPL8参与骨肉瘤发病的分子机制的研究》文中提出目的:RPL8在骨肉瘤中差异表达,并且与骨肉瘤化疗敏感性相关。本课题旨在找到RPL8参与调控骨肉瘤发病的分子机制,从而为临床上治疗骨肉瘤提供理论基础和新策略。方法:构建包含RPL8基因的质粒,转染He La细胞,使RPL8在He La细胞中过表达。用MTT测定法和流式细胞仪分别检测细胞增殖和凋亡;然后用RNA-seq技术分析RPL8过表达后所产生的的差异表达基因以及差异可变剪接事件,再通过进一步的GO和KEGG分析找到差异表达基因和差异可变剪接事件所对应的基因富集的功能通路,从而找到RPL8调控的与肿瘤相关的基因以及功能通路。最后筛选与骨肉瘤相关的基因及通路,并结合文献知识,找到RPL8可能调控骨肉瘤发病的分子机制。结果:通过细胞增殖和凋亡检测,发现RPL8在He La细胞中过表达后对细胞增殖水平影响不大,但可以明显促进细胞凋亡。通过RNA-seq技术分析发现,RPL8可以在转录水平和可变剪接水平广泛调节骨肉瘤相关基因的差异表达,进一步的GO和KEGG分析发现,RPL8调控的很多骨肉瘤相关的差异表达基因富集在与肿瘤发生发展相关的通路,比如:炎症反应,细胞增殖的正调控,血管生成等。结论:RPL8可能通过调控与骨肉瘤相关的基因如CCL26、DLL4、CD47、ERBB4、VHL、CASP3等的差异表达,来影响骨肉瘤的发生发展。
杨晓钢[8]（2021）在《通过生物信息学分析鉴定与骨肉瘤发生发展和预后相关的基因》文中研究表明目的:通过生物信息学分析技术对骨肉瘤基因表达谱芯片数据进行分析,从而筛选与骨肉瘤发生发展和预后相关的核心基因,并揭示其潜在的分子机制。方法:从GEO数据库获取GSE42352、GSE33382、GSE21257和GSE39055四个数据集,对前两个数据集进行差异表达分析,以韦恩图形式对DEGs取交集,对取交集得到的DEGs进行GO富集分析和KEGG富集分析,并绘制PPI网络筛选核心基因,随后使用GSE21257数据集进一步验证核心基因在转移组与非转移组的表达水平,最后使用GSE39055数据集中的生存资料来分析核心基因与骨肉瘤患者预后之间的关系。结果:共得到386个DEGs,其中上调基因204个,下调基因182个,GO富集分析表明DEGs主要参与免疫应答、RNA聚合酶II启动子转录的负调控等生物过程,在细胞成分方面,主要有细胞外基质、细胞浆膜等,在分子功能方面涉及到蛋白结合、相同蛋白结合等,KEGG通路富集分析提示DEGs主要参与细胞粘附分子、破骨细胞分化、癌症中的蛋白聚糖、ECM受体相互作用、P53信号通路等信号通路,从PPI网络中筛选出10个核心基因,其中IGFBP4、GAS6和IL6在骨肉瘤发生发展中一直呈低表达趋势,预后分析提示GAS6、IGFBP3、CYR61、LAMC1和FSTL3的表达水平与骨肉瘤患者的预后有关。结论:本研究鉴定了与骨肉瘤发生发展密切相关的核心基因IGFBP4、GAS6和IL6,增加人们对骨肉瘤发生发展机制的了解,并筛选出与骨肉瘤预后相关的核心基因GAS6、IGFBP3、CYR61、LAMC1和FSTL3,提供了新的预后标志物和潜在治疗靶点。
许良[9]（2020）在《微管亲和调节激酶2对骨肉瘤干细胞顺铂耐药性及骨肉瘤细胞发生发展的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分微管亲和调节激酶2在骨肉瘤中的表达及其临床意义研究背景:骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的骨原发恶性肿瘤,尽管年发病率只有3/100万,但严重危害青少年患者的身体健康。由于骨肉瘤具有明显异质性、基因组不稳定性和早期转移以及化疗效果不敏感的特点,骨肉瘤已成为青少年和青年人癌症相关死亡的主要原因。随着化疗技术和外科技术的进步,骨肉瘤的治疗方案由20世纪70年代以前的截肢治疗转变为日益规范的新辅助化疗-手术-辅助化疗的标准方案。未发生转移的骨肉瘤患者5年生存率由原先的不足20%提高到70%左右。尽管如此,近三十年来骨肉瘤患者的生存率未发生显着进步,而且发生转移的骨肉瘤患者5年生存率不足25%。近年来,各种恶性肿瘤的靶向治疗研究如火如荼的进行,很多肿瘤也取得了里程碑式的进展。NCCN指南中推荐索拉非尼（VEGFR抑制剂）作为骨肉瘤患者的二线治疗。因此,有必要进一步探索骨肉瘤新的分子机制,开发新的有效治疗靶点,改善骨肉瘤的预后。微管亲和调控蛋白 2（microtubule affinity-regulating kinase 2,MARK2）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是微管相关蛋白磷酸化的关键成分,并在细胞周期调控蛋白、Ⅱ型组蛋白等细胞因子的磷酸化中起重要作用。研究通过动物基因敲除实验发现,MARK2在神经分化、神经退行性变、细胞极化、细胞内转运及细胞迁移等作用中起重要作用。然而近年来研究发现,MARK2与肿瘤恶性生物学行为及耐药性存在着密切联系。在非小细胞肺癌、宫颈癌等恶性肿瘤中,MARK2高表达且与临床预后不良相关。但MARK2在骨肉瘤中的表达及其相关研究缺乏,因此我们首先进行尝试性探索微管亲和调节激酶2在骨肉瘤中的表达及其临床意义。研究目的本研究旨在探讨MARK2在骨肉瘤中的表达情况及与临床病理特征和预后之间的关系,为进一步研究MARK2在骨肉瘤中发生发展的作用及机制提供坚实基础。研究方法1.我们首先分析了公开数据库骨肿瘤患者中MARK2的表达和临床预后的关系。2.免疫组织化学检测骨肉瘤组织和骨母细胞瘤组织中MARK2蛋白表达情况,并分析骨肉瘤组织中MARK2表达与临床病理特征及预后之间的关系。研究结果1.GEO数据库（GSE12865）的分析发现与正常成骨细胞组织相比,骨肉瘤组织中的MARK2表达升高。TARGET数据的分析表明,MARK2高表达的骨肉瘤患者总生存率和无病生存率低,预后较差。2.免疫组织化学实验结果显示MARK2在骨肉瘤组织中的表达明显高于在骨母细胞瘤组织中的表达。而且MARK2的高表达与肿瘤大小（P=0.0322）,远处转移（P=0.0044）和对化疗的反应相关（P<0.0001）。Kaplan-Meier生存分析表明,MARK2表达较高的患者总体生存期较短。结论MARK2在骨肉瘤组织中高表达,并与肿瘤大小、远处转移和对化疗的反应及患者预后不良相关。第二部分MARK2在骨肉瘤干细胞顺铂耐药性中的作用及机制研究研究背景新辅助化疗、手术、辅助化疗的标准治疗方案使骨肉瘤患者的生存率得到明显的改善。骨肉瘤的标准化疗药物包括顺铂、多柔比星、异环磷酰胺和甲氨喋呤等。尽管最近在诊断和治疗方法上取得了进展,但进年来骨肉瘤患者的存活率仍然停滞不前,事实上仍有约35%的骨肉瘤患者会对上述4种化疗药物产生耐药,尤其是顺铂耐药,化疗耐药常常导致治疗失败,并导致骨肉瘤复发,转移或不可切除,这限制了当前骨肉瘤的治疗效果。因此,有必要进一步探索骨肉瘤的耐药机制,开发新的有效治疗靶点,以逆转骨肉瘤的化疗耐药,改善骨肉瘤的预后。肿瘤干细胞（CSC）是具有自我更新、分化潜能、高致瘤性、高度耐药等特征的一类恶性肿瘤细胞群,虽然在肿瘤中的数量所占比例极少,但对常规放化疗不敏感,被认为是肿瘤发生发展、化疗耐药、转移的根源,对肿瘤的治疗及预后有着重要的意义。因此,肿瘤干细胞理论是化疗耐药的重要原因,分离肿瘤干细胞、进行相关研究,找出药物靶点和相关的信号传导通路,为新的药物及治疗方法的开发提供理论支持。CD133抗原被认为是正常组织和癌组织的干细胞标记。研究鉴定出骨肉瘤细胞系中的CD133+细胞具有肿瘤干细胞的许多特征。肿瘤细胞DNA损伤修复能力也是化疗耐药的重要机制。多项研究发现,在胶质瘤、宫颈癌、非小细胞肺癌以及B细胞慢性淋巴细胞性白血病中,DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）及DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位（DNA-PKcs）的的活性和表达增高。本课题组前期研究发现,CD133+骨肉瘤细胞具有肿瘤干细胞的特性,该群细胞高表达MDR1、DNA-PK基因,在化疗耐药、肿瘤形成以及肿瘤恶性生物学行为中较为突出。DNA-PKcs高表达与骨肉瘤不良预后相关,复发转移的患者中DNA-PKcs 阳性率显着高于无瘤生存患者,DNA-PKcs可作为影响无瘤生存率的预后因素之一。但是,该机制的上游靶点尚不清楚。微管亲和力调节激酶2（MARK2）参与许多细胞功能的调节。近年来研究发现,MARK2与肿瘤的化疗耐药存在着密切联系。MARK2在顺铂耐药的宫颈癌细胞系中过表达。研究发现,在非小细胞肺癌中MARK2高表达并与顺铂抵抗具有密切关系,MARK2的过表达与DNA的低甲基化和复制密切相关。细胞系和原代细胞实验均显示了 MARK2在细胞周期激活和DNA损伤修复中的重要作用。下调MARK2表达后,肺癌细胞内DNA损伤增多、细胞周期发生S期阻滞、NF-κB的活性增高。对此该研究认为MARK2可以通过调节细胞周期增加细胞的DNA损伤修复。PI3K/Akt/mTOR通路的失调与包含骨肉瘤在内的多种肿瘤的化学耐药性有关。第一部分发现,MARK2在骨肉瘤的高表达与对化疗的反应相关,然而,MARK2能否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节DNA-PKcs的表达从而促进骨肉瘤干细胞对顺铂的耐药,仍需进一步研究明确。研究目的本研究旨在探讨MARK2在CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞中对顺铂耐药的作用及其潜在机制。研究方法1.通过MACS（免疫磁珠分选法）获得CD133-和CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞,分别用CCK8细胞活性实验检测其对顺铂的耐药性,并用qRT-PCR和蛋白质印记实验检测CD133-和CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞MARK2的表达。2.siRNA 下调 CD133+MG-63 和 MNNG/HOS 细胞中 MARK2 的表达后,检测顺铂耐药性的变化。3.分别用蛋白质印记实验和细胞免疫荧光实验检测顺铂作用之后CD133-和CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞中DNA损伤修复相关蛋白的表达情况。siRNA下调CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞中MARK2的表达后,检测DNA损伤修复的变化。4.应用蛋白质印迹法对比检测CD133-和CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞中PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白和DNA-PKcs的表达,并在CD133+细胞中加Akt抑制剂后,检测DNA-PKcs的表达水平和顺铂耐药性。下调CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞中MARK2的表达后,检测PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白DNA-PKcs的表达的变化。研究结果1.与 CD133-MG-63 和 MNNG/HOS 细胞相比,CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞显示出较高的顺铂耐药性和MARK2表达水平。2.下调MARK2降低了 CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞的顺铂耐药性,说明MARK2在CD133+MG-63和MNNG/HOS中促进顺铂耐药。3.与 CD133-MG-63 和 MNNG/HOS 细胞相比,CD133+MG-63 和 MNNG/HOS细胞顺铂作用后DNA双链断裂较少,DNA损伤修复蛋白增加。siRNA下调CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞中MARK2的表达后,DNA双链断裂增加,DNA损伤修复蛋白减少。结果说明MARK2可促进CD133+MG-63和MNNG/HOS的DNA损伤修复。4.与 CD133-MG-63 和 MNNG/HOS 细胞相比,CD133+MG-63 和 MNNG/HOS细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路中的关键蛋白、DNA-PKcs的表达水平升高。抑制P13K/Akt/mTOR信号通路的活性后,CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞中DNA-PKcs的表达水平和顺铂耐药性下降。下调MARK2后,CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路中的关键蛋白、DNA-PKcs的表达水平均降低。以上结果说明,MARK2可通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节DNA-PKcs的表达,从而增强CD133+MG-63和MNNG/HOS的顺铂耐药。研究结论1.MARK2在CD 133+MG-63和MNNG/HOS细胞中高表达且与顺铂耐药性有关。2.MARK2通过PI3K/Akt/mTOR信号调节DNA-PKcs的表达从而促进了CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞顺铂耐药,这提供了新的逆转骨肉瘤化疗耐药的策略和治疗靶点。第三部分MARK2在骨肉瘤细胞发生发展的作用及机制研究背景骨肉瘤具有恶性程度高,进展迅速,早期易发生转移的特点,转移90%发生在肺。骨肉瘤患者的主要死因就是肿瘤的肺转移。大约10-20%骨肉瘤患者在初诊时发生远处转移,并且约有50%以上的患者会在病程的不同时期发生转移。尽管标准治疗方案下骨肉瘤的生存率有了明显的提高,但发生转移的骨肉瘤患者5年生存率25%左右。所以远处转移是影响骨肉瘤患者预后的重要因素。对于复发、转移的难治性病例,索拉菲尼靶向药是NCCN推荐的二线药物。分子靶向药物是骨肉瘤的新兴治疗手段,对改善骨肉瘤的预后将会有重要的作用,因此有必要进一步研究骨肉瘤发生发展的机制,寻找新的改善骨肉瘤预后的生物标志物和治疗靶点。微管亲和调节激酶（MARKs）是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可磷酸化微管相关蛋白,例如Tau,并调节细胞骨架动力学和细胞周期进程。人体内有四种MARK形式（MARK1-4）,目前,越来越多的证据表明,MARKs具有多种功能,包括在细胞极性,神经元细胞分化、神经退行性病变、细胞内转运,细胞生长和细胞迁移中的作用。先前的一些研究还表明,MARKs在某些癌症的发生和发展中起着至关重要的作用。作为MARKs家族的成员,据报道,微管亲和调节激酶2（MARK2）通过各种信号途径介导细胞增殖,转移和化学药物耐药,因此在肿瘤的进展和预后中起着举足轻重的作用。第一部分研究发现MARK2在骨肉瘤中高表达,并与肿瘤大小、远处转移和不良预后相关。然而,MARK2在骨肉瘤发病机理和进展中的功能作用和分子机制仍然未知。研究表明,骨肉瘤基因具有高度的不稳定性,PI3K/AKT信号通路在晚期骨肉瘤病例中被激活并参与到骨肉瘤细胞发生发展中,包括细胞增殖,迁移侵袭和化疗耐药的调控。在我们先前的实验中,我们发现MARK2通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路增强骨肉瘤细胞的顺铂耐药性。然而,MARK2是否通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路促进骨肉瘤细胞增殖和转移尚待确定。研究目的研究旨在探讨MARK2在骨肉瘤进展和转移中的作用及潜在机制。实验方法1.用慢病毒建立稳定过表达或敲低MARK2的MG-63和MNNG/HOS细胞。CCK-8法检测细胞增殖情况。流式实验测细胞周期。2.过表达或敲低MARK2后,通过细胞划痕实验、Transwell细胞迁移、侵袭实验检测,观察骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力的变化,并用免疫印迹实验检测转移相关的基质金属蛋白2（MMP2）的表达。3.蛋白质免疫印迹实验检测MARK2过表达和沉默后PI3K/AKT/NF-κB信号通路相关关键蛋白表达水平。4.用PI3K抑制剂LY294002处理MARK2高表达细胞,进行挽救实验。CCK8、细胞流式实验、细胞划痕实验、Transwell细胞迁移、侵袭实验、免疫印迹实验检测PI3K抑制剂是否可以挽救MARK2过表达对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。5.建立裸鼠异种移植骨肉瘤模型,观察过表达和敲低MARK2对皮下肿瘤体积和重量的影响。免疫印迹实验检测裸鼠肿瘤标本中PI3K/AKT/NF-κB信号通路相关关键蛋白和MMP2的表达水平。免疫组织化学实验检测增殖能力相关的指标Ki-67。研究结果1.CCK8实验显示过表达MARK2促进骨肉瘤细胞的增殖水平。细胞流式实验显示MARK2的过表达显着降低了 G1期细胞的百分比,并增加了 S期细胞的百分比。相反,在下调MARK2的骨肉瘤细胞中观察到相反的结果。表明MARK2可能通过加速骨肉瘤细胞的G1-S期转变来促进细胞生长。2.过表达MARK2促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭,同时MMP2的表达水平升高。敲低MARK2抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭,同时MMP2的表达水平降低。表明MARK2可以通过促进MMP2的表达来促进促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。3.过表达MARK2促进骨肉瘤细胞PI3K/AKT/NF-κB信号通路中p-PI3K p85,p-AKT,p-NF-κB/p65 的蛋白水平升高。敲低 MARK2,p-PI3K p85,p-AKT,p-NF-κB/p65蛋白水平降低。结果表明,MARK2可以激活骨肉瘤中的PI3K/AKT/NF-κB 途径。4.挽救实验结果表明,在用LY294002处理的过表达MARK2骨肉瘤细胞中,细胞增殖能力下调,细胞周期G1期比例增加,S期细胞比例减少,细胞的迁移和侵袭能力下降,p-AKT,p-NF-κB/p65和MMP2的表达水平受到抑制,MARK2的表达不受影响,结果提示PI3K抑制剂可以挽救MARK2过表达对骨肉瘤细胞增殖,迁移和侵袭的作用,MARK2至少部分通过激活PI3K/AKT/NF-κB途径调节G1-S转变和MMP2表达来促进骨肉瘤细胞的增殖迁移和侵袭。5.过表达MARK2异种移植骨肉瘤肿瘤的体积和重量均增加。敲低MARK2,异种移植骨肉瘤肿瘤的体积和重量均降低。在过表达MARK2的小鼠肿瘤标本中p-AKT,p-NF-κ/p65,MMP2和Ki-67的表达水平显着增加,而在MARK2沉默的小鼠肿瘤标本中p-AKT,p-NF-κB/p65,MMP2和Ki-67表达水平降低。这些结果表明MARK2可能通过PI3K/AKT/NF-κB途径促进骨肉瘤细胞体内成瘤。结论MARK2通过PI3K/AKT/NF-κB通路调节G1-S相转变和MMP2表达,从而促进了骨肉瘤细胞的增殖,迁移和侵袭。结果提示MARK2可作为骨肉瘤患者的一种新的癌基因和有潜力的治疗靶标。
刘明阳[10]（2020）在《人参皂苷Rg3抑制人骨肉瘤细胞增殖及其分子机制研究》文中研究指明研究背景:骨肉瘤是发源于间充质干细胞的恶性肿瘤。骨肉瘤的发病年龄呈现双峰分布,常发病于青少年或老年人。由于大多数的骨肉瘤患者在诊断时时就有转移或微转移性,故几乎所有患者在手术切除的之前或之后都会接受多种药物联合化疗。患者往往耐受度较差,且复发几率较高。人参是一种原产于东北亚的草本植物,在东亚地区的传统医学中有着广泛的应用。作为人参中主要的活性物质之一,人参皂苷Rg3的抗肿瘤作用在近年来越来越引起人们的重视。人参皂苷Rg3的甾体结构使得它可以与细胞膜、膜结合离子通道、以及胞内和胞外的受体相互作用来改变细胞的转录水平以来发挥抗肿瘤作用。研究方法:本实验应用MTT实验、流式细胞术、细胞划痕实验、Transwell细胞侵袭实验检测了人参皂苷Rg3对骨肉瘤细胞系MG-63、HOS和U2OS增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响和对细胞周期作用。我们又进一步选择MG-63细胞作为研究对象,应用western blot、定量PCR、流式细胞术、小干扰RNA等实验手段进一步探究人参皂苷Rg3诱导细胞自噬、凋亡以及细胞周期阻滞的具体作用机制。实验结果:MTT实验发现人参皂苷Rg3以剂量依赖的方式抑制三种骨肉瘤细胞系MG-63、HOS以及U2OS的增殖。流式细胞术则验证人参皂苷Rg3的促三种肉瘤细胞系的凋亡。细胞划痕实验和Transwell细胞侵袭实验验证了人参皂苷Rg3可以抑制三种骨肉瘤细胞系的迁移和侵袭。WB实验发现经人参皂苷Rg3处理的的骨肉瘤细胞MG-63中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的水平与未加药的对照组相比有显着性地升高。Western blot和定量PCR证实人参皂苷Rg3组caspase-3的基因和蛋白表达水平增加,流式细胞术证实人参皂苷Rg3组细胞凋亡水平升高。而当我们使用代表性自噬通路抑制剂3-MA和人参皂苷Rg3同时作用于MG-63细胞时,WB实验和定量PCR显示3-MA可以显着逆转由人参皂苷Rg3导致的细胞凋亡和自噬相关蛋白的转录和表达水平的变化。而用小干扰RNA技术沉默LC3基因可以显着逆转人参皂苷Rg3导致的MG-63细胞的凋亡和迁移侵袭受限。WB实验显示人参皂苷Rg3可以使p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTORC1/mTORC1表达水平降低,而LC3/β-actin的表达水平增高,而加入PI3K激动剂IGF-1则可以逆转人参皂苷Rg3导致的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTORC1/mTORC1和LC3/β-actin表达水平的变化。流式细胞术检验经人参皂苷Rg3处理的骨肉瘤细胞系MG-63、HOS、U2OS处于G0/G1的细胞的比例上升,处于S期的细胞比例下降。WB实验结果显示人参皂苷Rg3处理的MG-63细胞中cyclinA、cyclinB的表达未见明显改变,而cyclinD1、CDK-4以及CDK-6的表达量显着下降,上游调节因子p53、p21的表达量显着上升。用小干扰RNA技术沉默p53基因可以显着逆转人参皂苷Rg3导致的周期阻滞作用和p21、cyclinD1、CDK4、CDK6表达水平的变化。实验结论:人参皂苷Rg3通过抑制PI3K/Akt/mTORC1,降低自噬抑制因子mTORC1的表达,引发细胞的自噬,LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平的增高,继而引起凋亡基因caspase-3转录和表达水平的升高并最终导致MG-63细胞的凋亡。同时,人参皂苷Rg3可以通过激活p53/p21来抑制G1期向S期转化的关键性蛋白cyclinD1和CDK-4、CDK-6的表达和活性使骨肉瘤细胞阻滞于G0/G1期。
二、细胞周期调控与骨肉瘤（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞周期调控与骨肉瘤（论文提纲范文）
（1）长链非编码RNA LINC01614通过miR-520a-3p/SNX3调控轴促进骨肉瘤进展的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 LncRNAs的结构及功能特点 |
| 1.2.1 LncRNAs的起源及分类 |
| 1.2.2 LncRNAs在细胞内的调控模式 |
| 1.2.3 LncRNAs的调控作用 |
| 1.3 LncRNAs在骨肉瘤中的研究进展 |
| 1.3.1 LncRNAs在骨肉瘤发病机制中的作用 |
| 1.3.2 LncRNAs参与调控骨肉瘤的分子通路 |
| 1.3.3 LncRNAs参与调控骨肉瘤的细胞通路 |
| 1.3.4 LncRNAs在骨肉瘤中的临床应用情况 |
| 1.4 CeRNA在骨肉瘤中的研究进展 |
| 1.4.1 CeRNA调控骨肉瘤的生物功能 |
| 1.4.2 CeRNA调节骨肉瘤的耐药 |
| 1.5 LINC01614、miR-520a-3p、SNX3 在肿瘤中的研究现状 |
| 1.5.1 LINC01614 在肿瘤中的研究现状 |
| 1.5.2 MiR-520a-3p在肿瘤中的研究现状 |
| 1.5.3 SNX3 在肿瘤中的研究现状 |
| 第二章 骨肉瘤中以LncRNAs为核心的调控网络构建及关键基因筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 骨肉瘤组织中差异表达lncRNAs、miRNAs及 mRNAs分子表达谱检测及分析 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.3 骨肉瘤中差异表达lncRANs靶基因的调控功能分析及以LINC01614、MALAT1 为中心的促癌调控网络提取和功能分析 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.4 LINC01614及MALAT1 在骨肉瘤细胞及骨肉瘤组织中表达水平的验证 |
| 2.4.1 实验材料 |
| 2.4.2 实验方法 |
| 2.4.3 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 LINC01614 在骨肉瘤中的调控功能研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 LINC01614 与骨肉瘤患者生存率及组织学分期有关 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 分析方法 |
| 3.2.3 分析结果 |
| 3.3 沉默LINC01614 抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭,并促进骨肉瘤细胞凋亡 |
| 3.3.1 实验材料 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.3.3 实验结果 |
| 3.4 沉默LINC01614 抑制骨肉瘤小鼠模型肿瘤生长 |
| 3.4.1 实验材料 |
| 3.4.2 实验方法 |
| 3.4.3 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 LINC01614 调控骨肉瘤发生发展的分子机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 LINC01614 通过miR-520a-3p调控骨肉瘤的生物功能 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.3 LINC01614 通过竞争性结合miR-520a-3p调控SNX3 的表达 |
| 4.3.1 实验材料 |
| 4.3.2 实验方法 |
| 4.3.3 实验结果 |
| 4.4 LINC01614/miR-520a-3p通过SNX3 调控骨肉瘤的发生与发展 |
| 4.4.1 实验材料 |
| 4.4.2 实验方法 |
| 4.4.3 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）长链非编码RNA参与骨肉瘤和胃癌增殖、迁移与耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分:长链非编码RNALBX2-AS1 通过LBX2-AS1/miR-5010-5p/WNT7B轴促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 LBX2-AS1 沉默 |
| 2.2.3 CCK-8 细胞活力检测 |
| 2.2.4 细胞迁移侵袭能力检测 |
| 2.2.5 生物信息学预测靶基因 |
| 2.2.6 荧光素酶报告检测 |
| 2.2.7 miRNA转染 |
| 2.2.8 实时定量PCR检测LBX2-AS1 的表达水平 |
| 2.2.9 蛋白免疫印迹分析 |
| 2.2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 LBX2-AS1 在骨肉瘤细胞中高表达 |
| 3.2 LBX2-AS1 促进骨肉瘤细胞的增殖 |
| 3.2.1 构建LBX2-AS1低表达的骨肉瘤细胞株 |
| 3.2.2 沉默LBX2-AS1 抑制了骨肉瘤细胞的增殖 |
| 3.3 沉默LBX2-AS1 的表达抑制骨肉瘤细胞的迁移 |
| 3.4 LBX2-AS1 通过miR-5010-5p调控WNT7B的表达 |
| 3.4.1 预测LBX2-AS1 可能通过结合miR-5010-5p进而调控下游基因WNT7B |
| 3.4.2 miR-5010-5p可以与LBX2-AS1和WNT7B结合 |
| 3.4.3 LBX2-AS1 调控miR-5010-5p和 WNT7B的表达 |
| 3.4.4 miR-5010-5p调控下游WNT7B的表达 |
| 3.5 抑制miR-5010-5p表达可以恢复沉默LBX2-AS1 对骨肉瘤细胞的增殖、迁移的影响 |
| 3.5.1 LBX2-AS1 低表达细胞系中抑制miR-5010-5p表达可以恢复WNT7B的表达 |
| 3.5.2 抑制miR-5010-5p的表达可以恢复沉默LBX2-AS1 所抑制的骨肉瘤细胞的增殖 |
| 3.5.3 抑制miR-5010-5p的表达可以恢复沉默LBX2-AS1 所抑制的骨肉瘤细胞的迁移 |
| 4 讨论 |
| 5 研究结论 |
| 第二部分:TUG1 在胃癌中作用的生物信息学分析及实验验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析方法 |
| 2.2.2 湿实验实验方法 |
| 2.2.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 生物信息学分析结果 |
| 3.1.1 患者的基线特征 |
| 3.1.2 胃腺癌中TUG1 高表达 |
| 3.1.3 TUG1 表达与临床特征的相关性 |
| 3.1.4 TUG1 的高表达提示预后不良 |
| 3.1.5 TUG1 在胃腺癌中的诊断价值 |
| 3.1.6 GO和 KEGG富集分析TUG1 的共表达基因 |
| 3.1.7 GSEA识别与TUG1 相关的生物学过程和信号通路 |
| 3.2 湿实验结果 |
| 3.2.1 TUG1 在胃癌患者表达水平高,与淋巴结转移及Ki-67密切相关 |
| 3.2.2 TUG1 高表达患者生存分析 |
| 3.2.3 TUG1 高表达可能与耐药相关 |
| 3.2.4 TUG1 促进胃癌细胞的耐药 |
| 3.2.5 TUG1 促进胃癌细胞迁移和侵袭 |
| 4 讨论 |
| 5 研究结论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的研究成果 |
| 综述 非编码RNA在骨肉瘤发病、诊断和预后中的作用 |
| 参考文献 |
（3）TIPE1介导PRMT1调控STAT3精氨酸甲基化修饰参与骨肉瘤增殖机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 免疫分子TIPE1对骨肉瘤细胞增殖等生物学行为的影响 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 TIPE1调控PRMT1/STAT3通路影响骨肉瘤增殖的分子机制研究 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 临床标本验证TIPE1抑制STAT3表达参与骨肉瘤发生 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（4）环状RNAcirc＿001422通过调节miR-195-5p/FGF2/P13K/Akt信号轴促进骨肉瘤增殖与转移（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 一、 骨肉瘤概述 |
| 二、 分子祀向治疗在骨肉瘤中的应用 |
| 三、 非编码RNA在骨肉瘤中的潜在生物学作用 |
| 第一章 Circ＿001422的鉴定及临床相关性分析 |
| 一、 材料和方法 |
| 二、 结果 |
| 三、 讨论 |
| 第二章 Circ＿001422对骨肉瘤细胞增殖和转移行为的影响 |
| 一、 材料和方法 |
| 二、 结果 |
| 三、 讨论 |
| 第三章 Circ＿001422通过海绵吸附miR-195-5p促进骨肉瘤细胞增殖与转移 |
| 一、 材料和方法 |
| 二、 结果 |
| 三、 讨论 |
| 第四章 Circ＿001422通过调控miR-195-5p/FGF2/PI3K/Akt信号轴发挥促癌作用 |
| 一、 材料和方法 |
| 二、 结果 |
| 三、 讨论 |
| 全文小结 |
| 一、 研宄结论小结 |
| 二、 论文创新点 |
| 三、 论文局限性 |
| 参考文献 |
| 缩写词简表 |
| 攻读硕士学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）甘草查尔酮A通过氧化应激与内质网应激抑制骨肉瘤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 甘草查尔酮A体外抑制骨肉瘤细胞增殖、诱导细胞周期阻滞 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 参考文献 |
| 第2章 氧化应激在甘草查尔酮A诱导骨肉瘤细胞凋亡中的作用 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 参考文献 |
| 第3章 ROS介导内质网应激在甘草查尔酮A诱导骨肉瘤细胞凋亡及自噬中的作用 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 参考文献 |
| 第4章 甘草查尔酮A在裸鼠皮下异位种植模型中抑制骨肉瘤生长的作用 |
| 4.1 实验材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 参考文献 |
| 综述 骨肉瘤治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（6）辛伐他汀调控YAP介导的SOX9转录抑制骨肉瘤转移的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 辛伐他汀通过调节SOX9表达来调控骨肉瘤细胞的迁移和侵袭 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SOX9是YAP-TEAD的直接靶基因 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 辛伐他汀通过调节YAP活性来调控SOX9转录 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 辛伐他汀通过RhoA和细胞骨架调节YAP活性以及SOX9表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五部分 辛伐他汀在体内抑制骨肉瘤细胞肺转移 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 他汀类药物抗肿瘤的机制及临床研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的科研成果及参加的学术会议 |
（7）RPL8参与骨肉瘤发病的分子机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1 研究内容 |
| 1.1 研究RPL8对细胞增殖和细胞凋亡的影响 |
| 1.2 转录组测序技术(RNA-seq)研究RPL8调控的差异表达基因(DEG)，并进一步通过功能通路(GO)和信号通路(KEGG)富集分析研究RPL8调控的差异表达基因富集的细胞通路 |
| 1.3 转录组测序技术(RNA-seq)研究RPL8调控的差异可变剪接事件(RASE)，并进一步通过功能通路(GO)和信号通路(KEGG)富集分析研究RPL8调控的差异可变剪接基因富集的细胞通路 |
| 1.4 定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)验证RPL8调控的DEG和RASE |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 克隆和质粒构建 |
| 2.2 细胞培养和转染 |
| 2.3 基因过表达的评估 |
| 2.4 细胞增殖和凋亡测定 |
| 2.5 RNA提取和测序 |
| 2.6 RNA-Seq原始数据提纯和比对 |
| 2.7 差异表达基因(DEG)分析 |
| 2.8 差异可变剪接事件(RASE)分析 |
| 2.9 对DEG和RASE进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析 |
| 2.10 定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)验证DEG和RASE |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 骨肉瘤发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
（8）通过生物信息学分析鉴定与骨肉瘤发生发展和预后相关的基因（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 内容与方法 |
| 1 研究资料 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 数据预处理及筛选DEGs |
| 2.2 GO及 KEGG富集分析 |
| 2.3 PPI网络分析及核心基因筛选 |
| 2.4 核心基因的进一步分析 |
| 2.5 预后分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 高通量测序在骨肉瘤诊治中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（9）微管亲和调节激酶2对骨肉瘤干细胞顺铂耐药性及骨肉瘤细胞发生发展的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 微管亲和调节激酶2在骨肉瘤中的表达及其临床意义 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 NIARK2在骨肉瘤干细胞顺铂耐药性中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 MARK2在骨肉瘤细胞发生发展的作用及机制 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第四部分 综述 微管亲和力调节激酶（MARK)的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English articles 1 |
| English articles 2 |
（10）人参皂苷Rg3抑制人骨肉瘤细胞增殖及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 骨肉瘤的简介 |
| 1.1.1 骨肉瘤的发病机制 |
| 1.1.2 骨肉瘤的临床表现 |
| 1.1.3 骨肉瘤的组织学特征 |
| 1.1.4 骨肉瘤的影像学特征 |
| 1.1.5 骨肉瘤的分期 |
| 1.2 骨肉瘤的治疗 |
| 1.2.1 化学药物治疗 |
| 1.2.2 手术治疗 |
| 1.2.3 新型疗法 |
| 1.3 人参皂苷Rg3的抗肿瘤作用 |
| 1.3.1 人参皂苷的简介 |
| 1.3.2 人参皂苷Rg3的抗肿瘤机制 |
| 1.4 细胞自噬与肿瘤 |
| 1.4.1 细胞自噬的简介 |
| 1.4.2 自噬与肿瘤 |
| 1.5 细胞周期与肿瘤 |
| 1.5.1 细胞周期的介绍 |
| 1.5.2 细胞周期的调节 |
| 1.5.3 细胞周期与肿瘤 |
| 第2章 人参皂苷Rg3抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭的研究 |
| 2.1 实验样本 |
| 2.2 实验所需试剂材料和设备 |
| 2.2.1 主要试剂及材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 骨肉瘤细胞的培养 |
| 2.3.2 MTT法检测药物对细胞增殖的抑制作用 |
| 2.3.3 流式细胞分析 |
| 2.3.4 划痕实验 |
| 2.3.5 Transwell侵袭实验 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 MTT法检测骨肉瘤细胞的增殖 |
| 2.4.2 人参皂苷Rg3促进骨肉瘤细胞凋亡 |
| 2.4.3 人参皂苷Rg3抑制骨肉瘤细胞的迁移能力 |
| 2.4.4 人参皂苷Rg3抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 人参皂苷Rg3促进骨肉瘤细胞MG-63自噬和凋亡的实验研究 |
| 3.1 实验样本 |
| 3.2 实验所需试剂材料和设备 |
| 3.2.1 主要试剂及材料 |
| 3.2.2 主要仪器及设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞的培养与传代 |
| 3.3.2 定量PCR |
| 3.3.3 Western blot实验 |
| 3.3.4 划痕实验 |
| 3.3.5 Transwell细胞侵袭实验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 人参皂苷Rg3促进MG-63细胞的自噬与凋亡 |
| 3.4.2 加入自噬抑制剂可以抑制人参皂苷Rg3导致的凋亡 |
| 3.4.3 沉默LC3基因可以抑制人参皂苷Rg3导致的凋亡 |
| 3.4.4 人参皂苷Rg3 通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路诱导自噬和凋亡 |
| 3.4.5 激活PI3K信号通路可以逆转人参皂苷Rg3 导致的MG-63 细胞凋亡比例的增加和迁移侵袭的抑制 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 人参皂苷Rg3抑制骨肉瘤细胞细胞周期的实验研究 |
| 4.1 实验样本 |
| 4.2 实验所需试剂材料和设备 |
| 4.2.1 主要试剂及器材 |
| 4.2.2 主要仪器及设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养与传代 |
| 4.3.2 流式细胞检测细胞周期 |
| 4.3.3 Western blot实验 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 人参皂苷Rg3阻滞骨肉瘤细胞阻滞于G0/G1期 |
| 4.4.2 人参皂苷Rg3对骨肉瘤细胞系MG-63周期蛋白及其依赖性激酶的作用 |
| 4.4.3 人参皂苷Rg3对细胞周期相关上游通路调控因子p53/p21的作用 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、细胞周期调控与骨肉瘤（论文参考文献）
- [1]长链非编码RNA LINC01614通过miR-520a-3p/SNX3调控轴促进骨肉瘤进展的分子机制[D]. 蔡启轩. 吉林大学, 2021(01)
- [2]长链非编码RNA参与骨肉瘤和胃癌增殖、迁移与耐药的机制研究[D]. 刘媛. 南昌大学, 2021(01)
- [3]TIPE1介导PRMT1调控STAT3精氨酸甲基化修饰参与骨肉瘤增殖机制研究[D]. 刘光平. 山东大学, 2021(12)
- [4]环状RNAcirc＿001422通过调节miR-195-5p/FGF2/P13K/Akt信号轴促进骨肉瘤增殖与转移[D]. 杨炳生. 南方医科大学, 2021
- [5]甘草查尔酮A通过氧化应激与内质网应激抑制骨肉瘤的机制研究[D]. 梁远. 扬州大学, 2021(02)
- [6]辛伐他汀调控YAP介导的SOX9转录抑制骨肉瘤转移的作用及分子机制研究[D]. 杜兴. 重庆医科大学, 2021(01)
- [7]RPL8参与骨肉瘤发病的分子机制的研究[D]. 杨贵. 新疆医科大学, 2021(10)
- [8]通过生物信息学分析鉴定与骨肉瘤发生发展和预后相关的基因[D]. 杨晓钢. 新疆医科大学, 2021(09)
- [9]微管亲和调节激酶2对骨肉瘤干细胞顺铂耐药性及骨肉瘤细胞发生发展的作用及机制研究[D]. 许良. 山东大学, 2020(04)
- [10]人参皂苷Rg3抑制人骨肉瘤细胞增殖及其分子机制研究[D]. 刘明阳. 吉林大学, 2020(01)