基于转录组测序探究鸡SOCS3蛋白在NDV逃逸宿主天然免疫中的作用机制

论文摘要

新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的严重影响世界养禽业发展的传染病之一。前期研究表明NDV的非结构蛋白V蛋白在拮抗宿主天然免疫过程中发挥重要作用,但对于NDV是如何调控宿主蛋白来逃逸宿主天然免疫鲜有报道。在本研究中我们通过转录组测序技术筛选出参与NDV逃逸宿主天然免疫的分子并对其诱导机制进行研究,为揭示NDV致病机理以及如何逃逸宿主天然免疫提供理论基础。NDV强毒株的感染能够引起禽类淋巴器官的迅速萎缩。法氏囊作为鸟类特有的免疫器官,在抵御外源微生物的入侵过程中发挥着重要作用。然而针对NDV引起法氏囊的免疫反应鲜有报道。在本研究中,用0.2 mL效价为2×104PFU/mL的NDV强毒株F48E9通过点眼滴鼻的方式感染四周龄的SPF鸡,并将注射等体积的PBS组作为阴性对照。随机采集感染48和72 h后感染组和对照组鸡的法氏囊进行转录组测序分析。结果发现,在感染后48 h,与对照组相比一共产生256个差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）,其中216个DEGs是上调基因,40个DEGs是下调基因;在感染后72 h,与对照组相比一共产生1419个差异表达基因,其中有1132个DEGs是上调基因,287个DEGs是下调基因。通过分析这些DEGs所富集的信号通路发现,在48和72 h感染组中共富集到28条信号通路（p<0.05）,其中在48 h感染组中有9条富集的信号通路,72 h感染组中有19条富集的信号通路,并且这些信号通路大部分与免疫和代谢相关。NDV感染诱导法氏囊产生强烈的免疫反应并没有对入侵的病毒进行有效地清除。为探究NDV是如何逃逸宿主免疫系统的监视,本研究通过分析NDV感染机体后48和72 h法氏囊共表达的DEGs,发现SOCS3基因在这两个时间点持续性表达。SOCS3对JAK-STAT信号通路具有负反馈调控作用,已证实其可参与多种病毒逃逸宿主免疫过程,然而在NDV的感染过程中未曾报道。为进一步探究SOCS3在NDV感染中作用机制,本研究通过NDV感染CEF细胞后发现,NDV的感染能够显著诱导SOCS3的表达,且SOCS3的表达与NDV毒力大小及病毒滴度呈正相关。通过比较NDV各个蛋白对SOCS3表达的影响发现,非结构蛋白V蛋白在诱导SOCS3表达中有显著的增强作用,且其C端结构域发挥着关键的诱导作用。在过表达或干扰内源性SOCS3表达时,NDV的增殖受到显著促进或抑制。机制研究表明,SOCS3可通过影响STAT1蛋白的磷酸化来影响OASL和MX1等干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes,ISGs）的表达来影响NDV的增殖,同时MEK/ERK信号通路在NDV诱导SOCS3产生过程中也发挥着重要作用。研究表明miRNAs在病毒感染中发挥着重要的调控作用,本研究利用生物信息学分析并筛选出靶向调控SOCS3表达的预测miRNAs（gga-miR-455-5p）。通过双荧光素酶报告基因试验、qRT-PCR和Western Blot验证了gga-miR-455-5p对SOCS3基因表达的调控作用,并且证实了NDV感染CEF细胞后能够抑制gga-miR-455-5p的表达。在CEF细胞中转染gga-miR-455-5p模拟物或抑制剂后,明显抑制或促进NDV的增殖。机制研究表明,gga-miR-455-5p除了通过调控SOCS3的表达,还可以通过靶向降解NDV NP基因及增强IFNβ、OASL和MX1的表达来实现抑制NDV感染。综上所述,本研究通过分析F48E9感染鸡体后48和72 h法氏囊的转录组数据,在CEF细胞中阐明NDV的感染能够通过MEK/ERK信号通路以及抑制gga-miR-455-5p的表达来诱导SOCS3的表达,进而通过抑制JAK-STAT信号通路的传递来帮助病毒逃逸宿主的天然免疫。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 新城疫概述

1.1.1 新城疫的发现

1.1.2 临床症状

1.2 新城疫病毒概述

1.2.1 新城疫病毒分类

1.2.2 新城疫病毒毒力测定

1.2.3 新城疫病毒病原学特征

1.2.4 新城疫病毒复制

1.3 新城疫病毒诱导家禽的天然免疫反应

1.3.1 JAK-STAT信号通路概述

1.3.2 NDV逃逸宿主天然免疫

1.4 转录组测序技术及其应用

1.5 SOCS蛋白家族研究进展

1.5.1 SOCS蛋白结构

1.5.2 SOCS蛋白功能

1.6 本研究的目的与意义

第二章 NDV感染鸡体后法氏囊组织的转录组测序与分析

2.1 材料

2.1.1 动物、细胞和毒株

2.1.2 实验试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 常规试剂配制

2.2 试验方法

2.2.1 病毒增殖

2.2.2 噬斑试验

2.2.3 标准曲线的制备

2.2.3.1 引物设计

2.2.3.2 病毒RNA的提取

2.2.3.3 反转录

48E₉ P基因的扩增'> 2.2.3.4 F₄8E₉P基因的扩增

2.2.3.5 重组质粒的构建

2.2.3.6 重组质粒拷贝数的计算

2.2.3.7 标准曲线的建立

2.2.4 动物攻毒试验

2.2.5 苏木精-伊红染色（HE）

2.2.6 转录组测序

2.2.7 实时荧光定量PCR

2.2.8 数据统计

2.3 结果

2.3.1 NDV感染鸡体后的临床病理变化

2.3.1.1 针对NDV P基因的标准曲线建立

2.3.1.2 NDV感染后的临床得分指数和存活率

2.3.1.3 法氏囊的病理变化

2.3.1.4 NDV诱导法氏囊产生的免疫反应

2.3.2 测序质量评估

2.3.2.1 法氏囊总RNA质量检测

2.3.2.2 参考序列比对分析

2.3.2.3 RNA-Seq相关性分析

2.3.3 差异表达基因分析

2.3.3.1 差异表达基因数量统计

2.3.3.2 差异表达基因GO富集

2.3.3.3 差异表达基因信号通路分析

2.3.4 转录组数据验证

2.3.5 48h和72h共表达DEGs分析

2.3.5.1 蛋白互作网络分析

2.3.5.2 共表达DEGs的GO富集和KEGG分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 NDV依赖MEK/ERK信号通路诱导SOCS3的产生促进病毒增殖

3.1 材料

3.1.1 实验材料

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 质粒构建

3.2.2 SOCS3的原核表达

3.2.2.1 原核表达条件

3.2.2.2 菌体的收集和超声破碎

3.2.2.3 包涵体蛋白的洗涤与变性

3.2.2.4 表达产物的SDS–PAGE分析

3.2.2.5 多克隆抗体制备

3.2.3 鸡胚原代成纤维细胞（CEFs）的制备

3.2.4 间接免疫荧光

3.2.5 半数组织感染剂量（TCID50）的计算

3.2.6 细胞活力检测

3.2.7 荧光定量PCR（q RT-PCR）

3.2.8 细胞转染

3.2.9 免疫印迹（Western Blot）

3.2.10 数据统计

3.3 结果

3.3.1 SOCS3在转录组数据中的表达

3.3.2 SOCS3多克隆抗体的制备

3.3.2.1 SOCS3的原核表达

3.3.2.2 原核表达条件的优化

3.3.2.3 Western Blot检测SOCS3-His原核表达蛋白

3.3.2.4 SOCS3-His包涵体的溶解与变性

3.3.2.5 多克隆抗体识别细胞内源性SOCS3的检测

3.3.3 NDV的感染诱导SOCS3的表达

3.3.4 NDV V蛋白在诱导SOCS3的表达中发挥主要作用

3.3.5 过表达SOCS3蛋白促进NDV增殖

3.3.6 敲低内源性SOCS3的表达抑制NDV增殖

3.3.7 MEK/ERK信号通路参与NDV诱导的SOCS3表达

3.3.8 抑制MEK/ERK信号通路促进NDV增殖

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 gga-miR-455-5p靶向调控SOCS3的表达抑制NDV增殖

4.1 实验材料

4.1.1 细胞和毒株

4.1.2 试剂

4.1.3 仪器

4.2 实验方法

4.2.1 靶向调控SOCS3表达的mi RNA的预测及筛选

4.2.2 miRNA靶向NDV基因组序列的筛选

4.2.3 双荧光素酶报告基因系统检测mi RNA与靶基因的结合

4.2.3.1 双荧光素酶报告基因重组质粒构建

4.2.3.2 双荧光素酶报告基因系统检测miRNAs的靶位点

4.2.3.3 免疫印迹（Western Blot）检测gga-miR-455-5p对NP以及SOCS3蛋白水平的影响

4.2.4 miRNA455-5p对NDV增殖的影响

4.2.4.1 NDV感染CEF细胞

4.2.4.2 RT-q PCR检测SOCS3、IRF3、IFN-β、OASL和MX1的相对表达

4.2.4.3 免疫印迹（WB）检测NDV HN蛋白的表达

4.2.4.4 噬斑实验和TCID50检测细胞上清中病毒滴度

4.2.5 数据统计

4.3 结果

4.3.1 靶向调控SOCS3表达的miRNA筛选

4.3.2 gga-miR-455-5p与SOCS33'UTR特异性结合

4.3.3 gga-miR-455-5p在m RNA和蛋白水平抑制SOCS3的表达

4.3.4 NDV的感染抑制gga-miR-455-5p的表达

4.3.4.1 NDV感染鸡后抑制gga-miR-455-5p在法氏囊中的表达

4.3.4.2 NDV感染CEF细胞后抑制gga-miR-455-5p表达

4.3.5 gga-miR-455-5p对NDV增殖的影响

4.3.5.1 gga-miR-455-5p过表达抑制NDV增殖

4.3.5.2 抑制内源性gga-miR-455-5p的表达促进NDV增殖

4.3.6 gga-miR-455-5p在NDV基因组上靶点的预测和验证

4.3.7 gga-miR-455-5p对干扰素和干扰素刺激基因的影响

4.4 讨论

4.5 小结

全文总结

本研究创新点

参考文献

附录

缩略词及中英文对照表

致谢

个人简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 王相伟

导师: 杨增岐

关键词: 新城疫病毒,转录组测序,法氏囊

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然科学基金项目(NO.31572538)

分类号: S852.65

DOI: 10.27409/d.cnki.gxbnu.2019.000090

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