任海涛[1]2004年在《胎儿皮肤免疫细胞表面标志和神经肽P物质的表达及意义》文中指出目的:比较胎儿皮肤、正常成人皮肤及增生性瘢痕(Hypertrophic scar, HS)中主要免疫细胞(巨噬细胞、T淋巴细胞、Langerhans细胞、肥大细胞)及神经肽P物质(Substance P, SP)阳性细胞的形态、分布和数量差异，从皮肤免疫-神经方面初步研究胎儿无瘢痕愈合机制。方法:收集胎龄为16~33周因车祸等原因引产的10例胎儿皮肤、7例正常成人皮肤以及18例HS，用免疫组织化学的方法分别检测巨噬细胞、T淋巴细胞、Langerhans细胞的表面标志CD68、CD3、CD1a的表达和神经肽P物质的表达；用甲苯胺蓝染色的方法检测肥大细胞。结果: 1. 胎儿皮肤CD68+巨噬细胞数显着少于正常成人皮肤CD68+巨噬细胞数(P<0.01)，正常成人皮肤的CD68+巨噬细胞数显着少于HS (P<0.01)。随着胎龄增加，巨噬细胞数量呈逐渐上升的趋势，但增长速度并不一致，在24至28周胎龄时上升迅速，以后又趋平缓。2.发育各期胎儿皮肤中均未发现CD3+T细胞；正常成人皮肤中CD3+T细胞数显着少于HS中CD3+T细胞数(P<0.01)。3.发育各期胎儿皮肤均未见CD1a+Langerhans细胞；正常成人皮肤中CD1a+Langerhans细胞显着少于HS(P<0.05)。4. 发育各期胎儿皮肤未发现典型的肥大细胞；正常成人皮肤中肥大细胞数显着少于HS中的肥大细胞(P<0.01)。5. 在
张恒术, 任海涛[2]2007年在《胎儿皮肤神经肽P物质和肥大细胞与无瘢痕愈合的关系》文中研究表明目的:比较胎儿、正常成人皮肤及瘢痕中神经肽P物质(substance P,SP)阳性细胞的形态、分布和数量差异,探讨P物质表达和肥大细胞数量与无瘢痕愈合之间的关系。方法:实验于2004-01/2005-01在重庆医科大学附属第一医院整形美容科和重庆医科大学病理教研室进行。收集胎龄为16～33周因车祸等原因引产的32例胎儿皮肤(家属知情同意)、26例整形手术中切除的正常成人皮肤以及18例不同时期的增生性瘢痕(患者均知情同意),用免疫组织化学的方法分别检测神经肽P物质的表达,P物质阳性细胞观察和计数采用分等级的方法。以细胞浆着色程度(浅、中、深)来判定。甲苯胺蓝染色的方法检测肥大细胞,在高倍镜下(×400倍)随机计数5个视野中阳性细胞数,取其平均值,为肥大细胞数。结果:①苏木精-伊红染色结果:孕早期胎儿皮肤表皮由1～3层细胞组成,真皮层细胞数量较多,胶原成分少、排列整齐,随着胎龄的增加,表皮细胞层数逐渐增加,出现角质层,逐渐分化为典型的五层细胞。②胎儿皮肤P物质的表达:孕22周以前胎儿皮肤中无P物质的表达,孕22周以后可见表皮细胞的下3层表达较多、且染色强度基本一致,随着胎龄的增加,至孕33周后的胎儿皮肤,P物质表达部位和阳性强度无明显变化。在正常成人皮肤中P物质表达于除角质层外的表皮全层,正常成人皮肤中的P物质染色强于胎儿皮肤;在瘢痕中P物质大量表达于表皮层、真皮中成纤维细胞及小血管周围,染色强。28周孕前胎儿皮肤、28周孕后胎儿皮肤、正常成人皮肤P物质的表达明显少于瘢痕组织(P<0.005)。③胎儿皮肤肥大细胞形态学观察结果:胎儿皮肤中未见典型的肥大细胞。正常皮肤肥大细胞计数少于瘢痕组织[(3.60±2.56),(8.41±4.06)个/视野,P<0.01]。结论:①胎儿发育早期(22周以前)皮肤中不表达P物质可能是早期胎儿皮肤无瘢痕愈合的原因之一。②瘢痕的形成同时与皮肤中的过多聚集并持续存在的肥大细胞和过多释放的P物质有关。
颜培宇[3]2010年在《不同穴位针刺对免疫抑制大鼠神经肽相关基因表达及免疫调节作用的分子机制研究》文中研究表明目的观察不同穴位针刺对免疫抑制大鼠神经肽相关基因表达影响，探讨其免疫调节机制，阐明针刺对免疫抑制机体神经内分泌免疫网络的作用。方法采用环磷酰胺腹腔注射法制备免疫抑制大鼠模型，通过RT-PCR法观察不同穴位针刺后免疫抑制大鼠脑组织β-EPmRNA、SPmRNA表达的变化；采用We s t e r n - b l o t法观察脾脏淋巴细胞表面β-EPR及SPR表达情况；通过流式细胞仪检测血中CD4+T细胞和CD8+T细胞的含量；采用ELISA法检测针刺对各组大鼠血清IL-4、IFN-γ含量的影响。结果不同穴位针刺能够提高免疫抑制大鼠脑垂体β-EPmRNA、下丘脑SPmRNA表达，治疗各组与模型对照组比较有显着性差异（P <0 . 0 5），头针加足叁里、关元组( E组)效果最佳。针刺能够降低外周脾淋巴细胞表面SPR表达，提高外周脾淋巴细胞表面β-EPR表达；同时不同穴位针刺能提高外周血CD4+T细胞含量，治疗各组与模型对照组比较有显着性差异（P <0.05），头针加足叁里、关元组效果最佳，与正常组比较无显着性差异（P > 0 . 0 5）、对CD8+T细胞无显着影响，与正常组比较无显着性差异（P> 0 . 0 5）；不同穴位针刺能显着降低免疫抑制大鼠血清IL-4水平，治疗各组与模型对照组比较有显着性差异（P <0.05），头针加足叁里、关元组效果最佳，还可提高血清I FN-γ含量,治疗各组与模型对照组比较有显着性差异（P <0 . 0 5），头针加足叁里、关元组效果最佳。结论不同穴位针刺可以提高免疫抑制大鼠低下的细胞免疫功能，尤其以头穴加体穴效果最佳。其可能的机理是通过影响神经肽-免疫细胞受体-细胞因子通路完成的。
程飚[4]2002年在《创面愈合过程涉及的细胞信号转导及bFGF对信号通路的影响》文中指出目的 各类损伤引起机体的修复涵盖了一系列的生物学活动,通过细胞信号的传递引起细胞核内靶蛋白的表达,是一切生物学效应的基础。本研究拟通过对创面愈合过程中细胞信号活化状态的观察,认识参与组织修复信号间的调控关系,以及外用bFGF对信号通路的影响作用。为创面愈合的网络调控机制提供理论基础,同时为提高创面愈合的质量以及临床上生长因子的合理应用提供理论依据。 方法 利用大鼠深Ⅱ°烫伤模型,通过对烫伤大鼠愈合过程中各类修复细胞增殖、迁移、转化和凋亡活动中所涉及信号通路的表达情况观察,以及外用bFGF对信号蛋白的表达、抑制作用,初步确定该过程中主要其作用的信号系统MAPKs。在离体条件下,建立成纤维细胞烫伤诱导的凋亡模型,通过对MAPKs通路的激活或抑制作用,观察其下游靶蛋白的变化。收集人胎儿、成年和老年不同时期的皮肤标本以及不同愈合结局(增生性瘢痕、慢性溃疡和平坦瘢痕)组织标本。调查人体发育各阶段、不同修复结局皮肤内主要细胞酪氨酸激酶受体的表达差异。采用的方法有:免疫组化(免疫荧光)、原位杂交、DNA凝胶电泳、透射电镜、常规组织病理HE和V.G特染、逆转录聚合酶链式反应(PT-PCR)、共聚焦显微镜、Western blotting等。检测修复过程中增殖、凋亡及相关基因蛋白(如caspase、p53、Bcl-2、Bax、c-myc)的表达,以及MAPKs磷酸化蛋白的变化情况。对比不同发育阶段、不同愈合结局表皮生长因子受体和成纤维细胞生长因子受体的表达差异。 结果 我们划分叁个部分进行总结: 1 外源性bFGF对深Ⅱ°烫伤大鼠创面修复细胞增殖、凋亡、转化、再上皮化和迁移的影响 外源性bFGF诱导创面内成纤维细胞c-myc的表达,导致p53蛋白激活。随即引起PCNA、caspase3蛋白的改变,MAPKs参与该过程。外用bFGF后引起成纤维细胞TGF-β1的表达增加,对成纤维细胞向肌成纤维细胞转化发挥作用,同时因加速愈合又对其凋亡的发生。外源性bFGF对血管内皮细胞的增殖作用不明显,但改
杜青香[5]2012年在《腭裂术后腭部粘膜瘢痕组织中肥大细胞的研究》文中研究表明目的：通过日本大耳白兔腭部造裂同时进行腭裂修复术,造裂的兔为实验组,未进行造裂的为对照组；叁个月后,采取静脉注射空气法处死,切取腭部造裂处的瘢痕组织,与对照组对应部位的正常粘膜组织,病理切片制作,光镜下观察对比研究,观察腭裂修复术后瘢痕组织与正常粘膜组织中肥大细胞的数量、形态、分布、及其与肥大细胞相关活性物质的变化。研究分两部分进行第一部分组织化学染色材料与方法：选7周龄,日本大耳白兔12只为研究标本,饲养7天后,随机抽取6只全麻下进行腭部造裂,同时进行腭裂修复手术；待腭部粘膜瘢痕形成,采取静脉注射空气法栓塞处死,取实验组及对照组相部位腭部粘膜1.0cm×0.5cm×0.5cm,4%中性福尔马林液固定。24小时后,石蜡包埋。石蜡组织切片4-5微米,常规脱蜡至水。用俾士麦棕、碘绿、马汀氏黄进行组合染色。光镜观察并照相。结果：1.肉眼观察实验组腭部粘膜瘢痕组织与周围正常粘膜组织界限明显,瘢痕区域腭皱襞消失,颜色较白,长约1.0cm,宽约0.5cm；质地较韧；证常粘膜颜色粉红,较软,腭皱襞明显。剖面实验组粘膜为灰白色或浅粉红色；对照组粘膜颜色粉红。2.实验组肥大细胞体积较大,形态不规则；3.实验组各细胞分层不明显,部分肥大细胞正在在脱颗粒；部分肥大细胞内尚有颗粒残存。对照组肥大细胞主要分布在固有层,多位于结缔组织的深层、血管、分泌管的周围,数量较少,轮廓清楚,未发现脱颗粒现象,胞浆内颗粒较少。第二部分免疫组化染色材料：同实验一方法：实验组及对照组进行BB-IG-MY组合染色的下一张连续切片,进行P物质和VIP血管活性肽免疫组化染色,组织标本贴于多聚赖氨酸处理的载玻片上烤片过夜。二甲苯、无水酒精、95%酒精分别浸泡,PBS缓冲液浸泡冲洗。擦干切片,温育,PBS缓冲液浸泡冲洗。擦干切片,正常山羊血清二工作液封闭,室温孵育,分别滴加稀释的兔抗人P物质抗体与VIP多克隆抗体,4-C过夜。滴加生物素标记的二抗工作液,辣根酶标记卵白素工作液,温育。PBS缓冲液浸泡冲洗,DAB显色。苏木素浸泡,分化液分化,返蓝。中性树胶封片。光镜观察并照相。结果：1.P物质反应物存在于肥大细胞的胞质内,呈颗粒状、褐色,胞核为阴性。2.对照组褐色颗粒较少见,颗粒集中；实验组褐色颗粒较多；且颗粒散在不集中。结论：1.两种染色方法均发现粘膜斑痕组织中肥大细胞数量均较正常粘膜中多。2.组合染色法更明显的显示肥大细胞的形态、结构、分布变化。显示了肥大细胞在瘢痕组织中与正常粘膜中的差异性。3.免疫组化染色显示瘢痕组织中褐色颗粒较多；且瘢痕粘膜组织中颗粒集中。而诈常粘膜中褐色颗粒较少,且散在分和。4.神经肽P物质在瘢痕形成过程中具有重要的作用,只是其与肥大细胞的关系作用机理上不太明确。
屈雷[6]2004年在《组织工程化角膜上皮与内皮的构建和移植》文中提出角膜作为眼球光学系统的重要组成部分，其上皮的完整性和透明度是良好视力的基本要求，临床上常见各种原因所引起的角膜缘干细胞及角膜上皮的损伤和缺失，使患者视力下降或致盲。上世纪九十年代以来，随着细胞培养技术和组织工程技术的兴起，组织工程化人工角膜、角膜上皮、内皮：基质细胞植片的构建与移植研究也正在兴起。为探索从根本上解决角膜疾患的新方法与途径，本研究用人流产儿、家兔和山羊角膜体外分离角膜缘干细胞、角膜基质细胞和内皮细胞；采用无饲养层细胞培养体系和冻存的角膜缘干细胞构建家兔和山羊角膜上皮组织，并自体移植到角膜缘干细胞完全缺失的动物模型角膜表面，恢复病损角膜上皮；同时，探索来源于自体的表皮干细胞替代角膜缘干细胞用于角膜上皮重建的可行性；利用体外快速扩增获得角膜内皮细胞，以羊膜和角膜基质为载体构建组织工程化角膜内皮组织，为组织工程角膜内皮层移植实验奠定基础。实验研究主要取得以下六个方面成果和进展： 1．流产儿角膜细胞经体外分离培养可甩于组织工程化角膜组织构建，并且认为移植时同种异体免疫反应更弱。但是，就人胎儿角膜细胞体外分离培养的条件和各类细胞的生长特性未见系统报道，资料相对缺乏。为了充分利用好胎儿角膜组织这一资源，本研究对30例人流产胎儿角膜上皮细胞，基质细胞和内皮细胞进行体外分离培养。发现胎儿角膜上皮细胞采用dispase消化法和完整的全层角膜组织贴壁法可获得纯化的角膜上皮细胞，传至10代冷冻保存；胎儿角膜基质细胞无论采用消化法还是组织块法都可得到纯化培养的目的，传至20代冷冻保存；而角膜内皮细胞体外纯化培养比较困难。 2．山羊或家兔角膜缘上皮组织用1．2 IU／ml dispase酶和0．25％胰蛋白酶4℃冷消化，认为1．2 IU／ml dispase酶是分离角膜缘干细胞较理想的消化酶，其作用时间以冷消化14h～16h为宜。比较DMEM／F12，RPMll640和EpilifeTM叁种培养液培养原代山羊和家兔角膜缘干细胞用DMEM／F12培养液可提高细胞的传代次数。山羊角膜缘干细胞传至20代，家兔角膜缘干细胞己传至14代，于一196℃液态氮冷冻保存，获得稳定增殖的角膜缘干细胞。将角膜缘干细胞分别保存在4℃、一20℃、一80℃冰箱和一196℃液态氮中，分别在12～48 h，l～7 d、1～6周和1～6月解冻，经体外培养扩增，细胞在形态上和增殖能力上与冻存前基本相似。可以满足不同的实验条件下，对角膜缘干细胞的运输、保存和增殖的要求，为组织工程技术构建角膜上皮提供丰富的细胞来源。 3．为了制作角膜缘干细胞完全缺失，用于移植角膜缘干细胞的动物模型，将角膜缘上皮板层切除，中央角膜用1 N NaOH擦除上皮层的方法，成功制作实验性角膜缘干
田婷[7]2017年在《人头皮真皮成纤维细胞来源Muse细胞的获取、鉴定和分化》文中进行了进一步梳理目的:1.免疫组化法、免疫荧光染色检测头皮中具有多能性基因的细胞分布。并且分离毛乳头,进行免疫荧光染色。2.通过流式细胞分选仪(Fluorescence-activated cell sorter,FACS)分选人头皮真皮成纤维细胞中抗SSEA3抗体阳性的细胞,获得应激耐受多系分化细胞(multilineage-differentiating stress-enduring cell),即Muse细胞,进行多能性鉴定。3.检测Muse细胞分化为黑素细胞、成骨细胞、肝细胞的能力,检测Muse细胞培养液对成纤维细胞增殖的影响,探讨可能的原因。方法:1.获取正常成年人的头皮标本,常规石蜡切片,进行SSEA3、Oct4、Sox2、Nanog、nestin免疫组化染色;同时对头皮标本进行冰冻切片,采用SSEA3和CD34免疫荧光染色。对体外培养的人毛乳头细胞进行SSEA3、CD34、α-SMA免疫荧光染色。2.采用FACS,从培养的头皮来源的真皮成纤维细胞,分选出抗SSEA-3抗体阳性的细胞(Muse细胞);进行碱性磷酸酶染色,用免疫荧光染色、逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)及Western-blot检测其多能性。用携带Oct4、Klf4、c-Myc、Sox2的慢病毒转染Muse细胞,获得诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)样克隆。3.通过添加不同的培养成份,诱导Muse细胞分别分化为:黑素细胞、成骨细胞、肝细胞。CCK8试剂盒检测Muse细胞的培养液对成纤维细胞的增殖影响。RT-PCR检测Muse细胞HGF、IGF基因的mRNA表达。结果:1.免疫组化染色结果显示:在正常人的头皮标本中,SSEA3阳性细胞分布于小汗腺、血管内皮、皮脂腺、毛乳头、外毛根鞘;少量Oct4阳性细胞分布于外毛根鞘、小汗腺、血管内皮;少数Sox2阳性细胞分布于小汗腺、毛乳头及外毛根鞘;少量nestin阳性细胞分布在小汗腺、血管内皮、生长期毛乳头中;Nanog染色显示阴性。免疫荧光染色结果显示:SSEA3分布在小汗腺、外毛根鞘、毛乳头,CD34主要分布在外毛根鞘、毛乳头。部分体外培养的人毛乳头细胞表达SSEA3、CD34。2.用FACS成功分选出SSEA-3阳性细胞(Muse细胞)。将分选出的细胞在2-羟乙基甲基丙烯酸脂(2-hydroxethyl methacrylate,Poly-HEMA)包被板中培养,采用甲基纤维素(Methylcellulose,MC)培养基,使之能悬浮生长,经过7~10天的生长,细胞成簇(Muse细胞簇),且直径达到最大。为了进一步扩增细胞,将悬浮生长的Muse细胞簇进行贴壁培养,可见细胞簇周边细胞放射状生长,光学显微镜下,细胞呈纺锤形。扩增后的Muse细胞再次悬浮培养,获得新Muse细胞簇,如此循环几次,获得大量的Muse细胞,用于多能性检测和诱导分化的研究。Muse细胞/Muse细胞簇对碱性磷酸酶染色显示阳性,即细胞呈紫红色,在细胞簇中央,染色更深。SSEA-3、Nanog、Sox2、Oct4阳性表达。经携带Oct4、Klf4、c-Myc、Sox2的慢病毒转染Muse细胞,获得iPSC样克隆,该克隆在荧光显微镜下呈现为绿色团块,表明转染成功。Muse细胞转染为iPSC的效率约为0.03%,高于亲本成纤维细胞(fibroblast cell,FC)的转染效率。RT-PCR结果显示:在Muse细胞以及Muse细胞形成的iPSC中,Oct4、Sox2、Nanog、hKlf4的基因表达均显着高于亲本成纤维细胞。并且,iPSC的Sox2、Oct4、hKlf4基因表达也比Muse细胞的高。Western-blot结果显示:Muse细胞及i PSC的Sox2、Oct4、Nanog蛋白的表达量高于亲本FC。3.体外诱导Muse细胞可分化为黑素细胞,并经HMB45、TYR免疫荧光染色证实。同时,将Muse细胞诱导分化为成骨细胞、肝细胞,诱导后细胞均进行特异性标记的免疫荧光鉴定证实。培养Muse细胞3天的培养液,以1:1的比例添加到FC培养基中,促进FC的增殖。结论:1.正常人头皮组织的免疫组化及免疫荧光检测显示:表达多能性因子的细胞集中于毛乳头、外毛根鞘、血管内皮、小汗腺等部位。部分体外培养的毛乳头细胞表达CD34和SSEA3。2.原代培养的头皮来源的真皮成纤维细胞,经FACS可以获得SSEA-3阳性的Muse细胞,这些细胞具有多能性及自我更新能力,转染Muse细胞为iPSC的效率比亲本FC高。3.Muse细胞可以诱导分化为黑素细胞、成骨细胞、肝细胞。Muse细胞培养液可以促进体外培养的FC增殖。
王一兵[8]2010年在《烧伤愈合过程中皮肤神经构筑的变化及其意义》文中提出目的：烧伤创面愈合是一个复杂而有序的生物学过程,包括炎性反应、细胞增殖、创面重塑几个阶段。关于创面愈合涉及的炎症细胞、修复细胞、炎症介质、生长因子和细胞外基质等成分的研究已有大量报道。诸多现象表明神经因素可能在创面愈合中具有重要作用,已有关于神经生长因子及神经肽对创面愈合影响的报道,但是少有对烧伤创面愈合过程中神经再生过程、再生神经形态学变化规律及其与创面愈合关系的研究。我们通过动物实验观察烧伤创面愈合过程中的神经变化情况,并通过研究消除神经因素及加强神经因素对创伤愈合速度和创面愈合质量的影响,初步确定皮肤神经对烧伤创面愈合的作用；同时观察人体不同时期伤区组织和瘢痕组织中的二、叁维形态等神经构筑情况,总结创面愈合过程中神经纤维的变化规律及其可能作用,从而初步探明神经与创面愈合的相互作用,为从神经角度调控创面愈合提供新的依据。方法：1.大鼠神经变化对烧伤创面愈合的影响随机将90只大鼠分为叁组：A组(失神经支配+烫伤,30只)B组(富神经支配+烫伤,30只)和C组(烫伤,30只)。将A组大鼠右侧T9-L1脊神经切断制作失神经支配模型；然后在A、B、C组大鼠背部右侧T9-L1节段制作直径2cm的深Ⅱ度烫伤创面。B组大鼠伤后注射NGF 1U/g.d只,连续14天制作富神经支配模型。伤后7、14、21天进行观察,取材。观察创面大体情况,计算创面愈合率及创面愈合时间；普通组织病理学观察炎性细胞、血管、上皮化等情况；以神经丝蛋白NFP作为神经标记物,利用荧光免疫组织化学法检测创面神经再生情况,通过神经容积分数(NVF)进行半定量分析；利用rt-PCR检测VEGFmRNA的表达水平,观察神经变化对血管形成的影响；免疫组织化学法观察Ⅰ、Ⅲ胶原分泌情况,通过胶原容积分数(CVF)进行半定量分析,并计算Ⅰ／Ⅲ型胶原比例的变化,观察创面愈合的质量。2.人烧伤愈合过程中神经的变化将取自人体的伤区组织或瘢痕组织分为叁个组：A组(Ⅲ度伤区组织,便于手术取材),伤后1周,2周,3周,4周组织各10例；B组(瘢痕组织),增生期瘢痕(≤6月)、成熟期瘢痕(>6月)各10例。C组为正常对照组,实验组和对照组按5：1标本取自以上患者的供皮区,共12例；改良叁色法染色,普通光学显微镜观察组织的病理学改变,并胶原面积／视野面积,计算胶原容积分数(CVF)进行半定量分析；筛选神经标记物,分别应用蛋白基因产物PGP9.5及神经丝蛋白作为神经标记物进行免疫荧光染色。利用效果良好NFP作为神经标记物进行实验；普通荧光显微镜观察神经纤维的平面结构和数量改变,计算神经容积分数(NVF)进行半定量分析；激光扫描共聚焦显微镜观察神经纤维的内部结构和叁维立体结构改变。结果：1.大鼠神经变化对烧伤创面愈合的影响创面组织学观察及创面愈合时间：伤后7天,B组炎性细胞浸润较A、C组明显,上皮化情况各组无明显差别；伤后14天,B组炎性细胞浸润情况开始缓解,上皮化快于A、C两组,A组上皮化落后C组。A组痂皮脱落较慢,愈合时间最短21天,最长26天,平均23.5±2.95天,B组痂皮脱落较快,创面愈合时间最短18天,最长20天,平均18.8±1.48天,C组愈合时间最短19天,最长22天,平均20.4±2.86天神经密度比较：伤后各时间点A组切片未见免疫阳性染色区域,B组、C组在伤区基底部可见NFP免疫阳性染色,其形状因界面不同而异,多呈圆点状,少数呈现细小短棒状。伤后14天,B、C组NFP免疫阳性染色区域开始增多,一般为圆点、短棒状,B组NVF高于C组(p<0.05)。伤后21天,B、C组NFP免疫阳性染色区域明显增多,呈圆点、短棒或者豆芽状。B组NVF显着高于C组(p<0.05)。大鼠皮肤神经短小难以叁维重建。VEGFmRNA表达情况：A、B、C组VEGFmRNA伤后开始升高,B、C组迅速升高,伤后7天即达高峰,A组升高较缓慢至伤后14天达到高峰。伤后21天各组维持相对较高水平,伤后21天B组VEGFmRNA显着高于C组(p<0.05),A组与C组无显着差异。伤后各时间B组VEGFmRNA表达一直高于其他两组。Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌情况及Ⅰ／Ⅲ型胶原比例变化：各组Ⅰ型胶原在伤后持续增加,A组Ⅰ型胶原分泌明显低于C组,B组Ⅰ型胶原明显高于C组；各组Ⅲ型胶原除A组持续升高外,其余两组无显着变化。伤后21天A组Ⅰ／Ⅲ型胶原比例显着低于C组,B组Ⅰ/Ⅲ型胶原比例与C组比较差异统计学意义。2.人烧伤愈合过程中神经的变化伤后胶原比例逐渐增大,到增生期CVF达到最高,成熟期趋于正常。PGP9.5组的灰度值,NVF值显着低于NFP组,PGP9.5染色阳性率低于NFP组(p<0.05)。伤后3周内神经纤维数目低于正常,3-4周后神经数目开始高于正常,并逐渐变长,随着时间延长出现扭曲缠绕或交错排列,分布呈现区域性集中；增生期瘢痕NVF达到最高,神经纤维分布杂乱,形态不规；成熟期瘢痕神经纤维NVF明显降低,接近正常,排列较规整；分层扫描和叁维重建可见伤后2周神经稀疏、短小,3周后神经纤维有不规则肿胀和扭曲变形,内部结构不完整并伴有局部断裂、破损甚至崩解,可见明显的皱褶和出芽,并呈现较正常神经纤维更强的荧光信号,在不同层次以及不同角度的切片上观察到的病理改变程度不同。结论：1.在大鼠及人烧伤创面愈合中,神经纤维密度逐渐增高；在人创面重塑期神经纤维密度先增高后降低。再生神经的形态、分布由简单到混乱再到规律,神经在创伤愈合过程中存在重构现象。2.利用激光扫描共聚焦显微镜技术,能分层扫描、并重建人伤区组织及瘢痕组织内神经纤维,观察到细微的形态变化,但是难以对大鼠皮肤神经进行重建。3.大鼠失神经支配伤区组织VEGFmRNA表达量较富神经支配创面组织低、愈合相对变慢,说明神经可以通过影响微血管再生对创面愈合产生影响。4.增强神经因素在创面早期可以促进创面愈合,减轻神经因素在创面重塑期有助于改善重塑质量
陈燕[9]2013年在《膀胱尿道功能发育及尿失禁治疗的临床与基础研究》文中研究说明背景和目的下尿路障碍在成人和小儿均常见。全球超过2亿人因为下尿路功能障碍就医。其中下尿路功能障碍引起的尿失禁最常见。膀胱逼尿肌-外括约肌功能协同失调(Detrusor-Sphincter Dysfunction, DSD)是导致婴幼儿尿失禁,遗尿的常见原因。压力性尿失禁(Strss Urinary Incontinence, SUI)和膀胱过度活动症(Overactive Bladder, OAB)-急迫性尿失禁(Urge Urinary Incontinece, UUI)是成人尿失禁常见的类型其病理生理变化分别是尿道横纹肌括约肌缺损、盆底肌肉松弛和DSD。这些成人和小儿下尿路障碍疾病的病因绝大部分与下尿路肌肉病变有关,其中以下尿路横纹肌肉功能紊乱为主。为了更好地说明下尿路横纹肌对尿失禁为主的下尿路障碍的发病机制的作用,有必要知道下尿路横纹肌在新生儿的正常发育和功能发展过程。目前对新生儿排尿控尿模式的研究报道不多,很多基于4小时自由排尿观察。不完全排尿在新生儿排尿中比例很高,早产儿明显多于足月儿。代表生理性DSD间断排尿在新生儿中也较常见,但更多见于早产儿,这说明新生儿的尿道横纹括约肌控尿很不成熟。因此有必要对人体出生后早期阶段-新生儿期的排尿方式发展过程进行研究,从而为新生儿期排尿发育补充数据,也能更好追述成年后尿失禁发生的原因。成人尿失禁主要有药品和手术治疗。OAB导致急迫性尿失禁患者目前主要是药物治疗,患者服用乙酰胆碱受体阻滞剂,如索利那新,托特罗定等。对于这类药物的疗效,有的报道服药后尿失禁症状有改善,有的报道患者无任何影响,有效与无效的比值,以及有效无效的标准,各个医疗中心报道不一致。并且这类药物对膀胱逼尿肌尿动力参数影响如何,国内少见报道。成人压力性尿失禁目前多采用手术治疗,如TVT/TVT-O手术。这个术后疗效如何,仍然是报道不一。因此我们对临床上OAB急迫性尿失禁患者服用索利那新12周的疗效和已行TVT/TVT-O手术的压力性尿失禁患者做了随访调查,发现M受体阻滞剂索利那新对大部分患者的OAB尿失禁状况有改善,但是仍然有部分患者无效。而压力性尿失禁的TVT/TVT-O手术治疗能缓解大部分患者的尿失禁,但仍然不能彻底解决尿失禁问题,并且很多患者自述有盆底慢性疼痛或者不适感,部分难治性尿失禁患者无任何治疗效果。还有其他研究人员报道了采用下尿路注射填充剂或者药物治疗压力性尿失禁,如尿道下牛胶原注射压力性尿失禁,A型肉毒毒素(Botulinum Toxin, BTX)治疗急迫性尿失禁等。这些治疗方法在短期的效果明显,但是长期效果差,并且有严重的并发症。目前,国际上热点的尿失禁的研究专注于再生修复受损尿横纹肌干细胞疗法或寻找细胞内新的药物分子靶点。组胺是生物体合成的活性氨,是由组胺酸脱羧而形成的,主要在肥大细胞,嗜碱性细胞,肠道嗜铬细胞中合成,参与机体免疫,生化等功能。组胺到目前为止已经发现有4种受体(H1R, H2R, H3R, H4R)。国内外学者已经对组胺受体(Histamine Receptor) H1R和H2R研究多年,这两种受体是传统的组胺受体,它们对组胺的亲和力PK1分别为4.2和4.3。在平滑肌细胞,心肌细胞和骨骼肌组织中均发现这2种受体的表达,并检查出他们参与细胞的增殖和收缩。而本世纪初,研究者才开始关注到某些细胞浆中存在分子量为73kD的组胺前体存在。这种前体在某些细胞中的含量比传统的组胺合成细胞低100到1000倍。据推测这些细胞中存在某种正电荷转运蛋白(cation transporter protein, CTP)可以帮助某些能少量合成组胺及其前体的细胞淹着浓度梯度转运组胺或前体到细胞外。这些组胺的浓度很低,不可能去激活传统的组胺H1R, H2R受体。因此人们开始寻找组胺新的受体。近10年,一些研究细胞膜上G-蛋白偶联的跨膜蛋白受体的研究者发现了组胺新的受体,组胺H3R, H4R受体。这两种新型组胺受体对组胺亲和指数PK1值分别为8.0和8.2,对组胺的结合力相当于前2种传统受体的10000倍。进一步的研究,许多能少量合成组胺的非传统合成细胞被发现,比如树突细胞,淋巴细胞等。他们均存在新型的组胺受体。同时在中枢和周围神经细胞突出前膜发现了H3R广泛存在。肌肉细胞中也发现了传统和新型的组胺受体,如在支气管平滑肌细胞中发现了组胺H1R, H2R, H3R;在心肌细胞中发现了H1R, H2R, H3R;肠道平滑肌和膀胱逼尿肌细胞中H1R, H2R, H3R, H4R存在。国外许多研究者己大量研究了组胺传统和新型受体在细胞中的信号传导的报道。据研究发现,4种组胺受体均为G-蛋白偶联跨膜蛋白受体(G-coupled transmembrane receptor, GCTR),其中H1R和H2R与Gas亚基偶联,加强腺苷环化酶活性,增加细胞内第二信使环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate, cAMP)的合成,增加PKA信号的传导和下游蛋白的磷酸化。H3R和H4R则与Gai亚基偶联,抑制腺苷环化酶(Adenlate cyclase,AC)的功能,降低细胞内第二信使cAMP的合成,抑制PKA信号的传导和下游蛋白的磷酸化。目前大量发现组胺新旧受体在其他器官的肌肉细胞中表达,我们开始研究组胺受体在成人尿道横纹肌括约肌和肌肉干细胞分化成横纹肌过程中的表达,进而探讨其在下尿路横纹肌中的功能和通路。本研究目的在于首先在临床上调查出正常新生儿下尿道排尿控尿功能发育参数,然后检测了临床上药物治疗成人OAB-UUI及手术治疗SUI的大体疗效情况,再通过实验室测量组胺受体在成人下尿路肌肉组织及其肌肉干细胞分化过程中的表达,最后探讨H3R对收缩中肌肉细胞胞浆中钙离子浓度及其可能的细胞内信号通路,初步探讨出组胺受体在下尿路功能障碍疾病中的作用,从而为以后临床治疗下尿路障碍提供新的可能的细胞内药物靶位点或者组织工程学治疗方法。第一部分新生儿控尿机制发育—新生儿期排尿功能发展研究材料和方法选取21例,无病理疾病的单胎正常新生儿。足月儿10例,早产儿11例；每位新生儿均被观察其出生第1天,4天,7天,14天,28天12h连续自由排尿,记录排尿时间、每次排尿量,B超测量排尿后残余尿量,排尿时清醒睡眠状态。结果共记录排尿745次。足月儿和早产儿的排尿次数均在天龄第7天时明显多余第4天(P<0.05)。早产儿的排尿次数在第14天时开始下降,第28天次数明显低于第14天(P<0.05)。足月儿的排尿量在28天记录数据中,明显增加了两次,早产儿在这28天中增加了一次。足月儿的残余尿在28天内有波动。足月儿在第14天和28天时,排尿次数明显少于早产儿(P<0.05)；但排尿量在第4,7,14,28天时,明显多于早产儿(P<0.05)；残余尿量在第4天,第28天时也明显多于早产儿(P<0.05)。不完全排空和间断排尿在早产儿中较足月儿多见。第二部分控尿机制失调—成人尿失禁的药物、手术治疗效果评估材料和方法1.20例OAB患者服用膀胱逼尿肌M3受体阻滞剂索利那新治疗。男12例,女8例。年龄21-83岁,平均43岁。病程1-20年,平均8年。患者连续服用索利那新5mg/d12周。服药前后行尿动力学检查,观察膀胱逼尿肌功能变化、记录OABSS得分、感知膀胱症状量表(PPBC)评分,统计学比较治疗前后的差异。2.选取已行TVT-O手术治疗0.5-3年的老年女性Ⅰ、Ⅱ型压力性尿失禁患者80例,术前年龄在60岁以上,采用ⅡQ-7生活质量和UDI-6症状量表进行电话问卷调查,比较患者术前术后日常生活与下尿路症状的差异。结果1.OAB患者治疗前后平均逼尿肌无抑制收缩波个数分别为2.3±2.4与0.6±1.3,差异有统计学意义(P<0.05)；其中6例患者服药后逼尿肌无抑制收缩完全消失。治疗前后膀胱初次排尿感容量(103士67ml与178±89m1)、膀胱容量(189士133ml与299士89m1)差异有统计学意义(P<0.01)；膀胱顺应性、最大尿流率时逼尿肌压力差异无统计学意义(P>0.05)。服药前后OABSS量表的尿急评分(5.0±0.0与2.8±2.0)、白天排尿评分(1.3±0.5与0.4±0.7)、夜尿评分(2.9±0.4与1.4±0.92)、尿失禁评分(3.3±2.1与1.6±2.1)、PPBC评分(5.5±0.5与2.9±1.6)差异均有统计学意义(P<0.05)。6例患者诉有口干现象。2.73例压力性尿失禁患者随访成功,年龄(60-72)岁,平均(64±6.5)岁。术前患者做家务、活动、娱乐、外出、社交及情绪明显受到尿失禁症状影响,评分为(9-25)分,平均(17±6.7)分；下尿路症状尿急、尿频、运动、漏尿量、排尿困难及尿痛评分为(8～21)分,平均(14±4.7)分。轻度尿频8.2%(6/73).尿垫使用率为97.3%(71例)。11例患者诉排尿有耻骨上区不适。术后患者自评生活质量明显改善,日常生活评分(2～13)分,平均(6.4±3.2)分,下尿路症状评分(1～9)分,平均(5.4±3.2)分。轻度尿频1.4%(1/73)。39例(53.4%)患者尿失禁症状完全消失,尿垫使用率46.6%(34例)。18患者诉术后排尿有轻度耻骨上区不适。第叁部分组胺受体在尿道横纹肌和成肌分化过程中的表达材料和方法1.诱导横纹肌肉干细胞C2C12的成肌分化,标志物：早期标志物desmin,中期标志物myogenin,晚期标志物肌球蛋白重链；实时定量聚合酶链反应(PCR)测量分化标志物和组胺4种受体(H1R, H2R, H3R, H4R)的mRNA表达。免疫荧光染色各标志物和组胺H3受体(histamine H3receptor, H3R)2.分化过程中,H3R拮抗剂Ciproxifan拮抗H3R受体6d,测量各标志物表达情况。3.收集临床上因成年男性中段尿道横纹肌标本,选取尿道外括约肌(横纹肌)部分做石蜡包埋,石蜡切片,免疫组织化学染色组胺4种受体。结果1. H1R mRNA在未分化的C2C12干细胞中表达较高,但随着成肌分化,表达逐渐减低；H2R mRNA在肌源性干细胞及其分化中表达均较低,但比较稳定。H3R mRNA在肌源性干细胞中表达很低,但是随着成肌分化表达呈指数增加。免疫荧光染色发现H3R蛋白染色随着分化而荧光强度增加。H4R在肌源性干细胞及其成肌分化中均未检测出表达。2.H3R阻滞剂Ciproxifan在分化过程中拮抗H3R,分化6天后,3种分化标志物表达与对照组相比,无差异(P>0.05)。3.成人下尿路横纹肌的免疫组织化学染色发现HIR, H2R, H3R染色阳性,其中H1R阳性程度最强,H3R中度阳性,H2R弱阳性。第四部分组胺H3R受体在横纹肌细胞收缩时对胞浆中钙离子的影响和可能的信号通路材料和方法1. Fluo-4标记的钙离子结合剂,测量双极交流电200mA刺激肌肉细胞时肌浆中钙离子的变化；H3R选择性激动剂a-甲基组胺(RMeHA)6种不同浓度(1nM,10nM,100nM,1uM,10uM,100uM)刺激在交流电下收缩的成熟肌肉细胞,测量收缩中钙离子浓度峰值的变化情况。2.荧光标记H3R拮抗剂HT-1240追踪H3R在成熟横纹肌细胞的表达定位及该物质在细胞内运输过程3.细胞环磷酸腺苷(cAMP)提升剂弗斯可林(forskolin)增加细胞内部cAMP表达；H3R激动剂RMeHA6种不同浓度(1nM,10nM,100nM,1uM,10uM,100uM)刺激成熟肌肉细胞,测量细胞表达cAMP的水平；4.用H3R阻滞剂Ciproxifan预处理细胞,测量6种不同浓度的RMeHA刺激细胞后cAMP的表达情况。结果1. RMeHA浓度为10nM,100nM,1uM,10uM时,刺激5min,10min,20min均能明显降低胞浆中钙离子峰值(P<0.05),而浓度为100nM的RMeHA在10min,20min对电刺激细胞中Ca2+的抑制百分率最高。整体看来,同一浓度的RMeHA对Ca2+的抑制效果,在20min内,随着时间的增加而稍有增加,即在20min时所见到的抑制效果比在5min时有所增加低浓度H3R激动剂。RMeHA低浓度1nM,高浓度100uM,对收缩细胞胞浆中钙离子峰值均无明显影响(P>0.05)。2. ST1240浓度越高,清洗细胞后,细胞内残存的荧光强度越高。3.静息细胞的基础cAMP浓度很低,弗斯可林10uM可以明显提高细胞内cAMP的合成。RMeHA1nM时,对细胞内由FK提升的cAMP无影响。RMeHA浓度10nM,100nM,1uM时能降低由FK增加的cAMP合成(P<0.05),并随浓度增加,cAMP在细胞中浓度下降。RMeHA高浓度(10uM,100uM)时,RMeHA的抑制效果不明显,甚至有提升细胞cAMP的作用。4.用CPF预处理细胞后,RMeHA在1nM时,对细胞内由FK提升的cAMP仍然无影响。但RMeHA浓度在10nM,100nM,1uM时候也能降低由FK增加的cAMP合成(P<0.05),并随RMeHA浓度增加,cAMP在细胞中浓度下降,与无处理组差别不大。RMeHA高浓度(10uM,100uM)时,RMeHA不出现抑制效果,而是有提升细胞cAMP的作用,并且比不处理组提高cAMP效果更明显(P<0.05)。结论1.新生儿期尿道横纹肌的发育主要表现在新生儿排尿模式的变化。间断排尿和不完全排空现象预示着膀胱-尿道括约肌(横纹肌)协同失调。在足月儿和早产儿中,可见间断排尿,而早产儿更常见。这预示着他们下尿路肌肉发育的成熟度很低导致排尿功能很不成熟,早产儿更显着。但是第28天时的新生儿的间断排尿明显少于出生后1天和4天的新生儿。总之,新生儿膀胱-尿道括约肌(横纹肌)协同失调的改善过程显示了尿道横纹肌在新生儿期逐渐发育的过程。2.成人的尿道横纹肌功能紊乱导致的疾病主要是OAB引发的尿失禁和压力性尿失禁。膀胱逼尿肌M3受体阻滞剂索利那新药物治疗膀胱过度活动症在特发性OAB的病人有很大疗效,但是对一部分病人,比如膀胱-尿道括约肌协同失调的OAB-UUI患者病人效果不明显,甚至无效。TVT/TVT-O手术对因盆底肌肉松弛导致的压力性尿失禁有一定疗效,但是部分病人复发率和不适感明显。因此需要引入对尿失禁-下尿路障碍的新治疗理念,如组织工程学治疗或者新的药物细胞分子靶位点。3.组胺受体在肌肉细胞的分化,成熟,功能,修复方面起到了十分重要的作用。在肌肉干细胞分化为横纹肌细胞过程中和成年男性尿道横纹肌中发现H1R, H2R和H3R。其中H1R受体可能参与细胞的增殖,H2R受体可能参与细胞胆碱能刺激后的松弛,H3R在成肌分化过程中没有发现参与分化功能,可能与成熟细胞的生理功能相关。4.H1R和H2R这两个受体可能与G蛋白激动性亚基阿尔法相偶联,增加腺苷环化酶的活性。然而最重要的H3R可能与G蛋白抑制性亚基Gi/o相偶联,抑制腺苷环化酶,进而降低细胞内cAMP表达,抑制PKA通路,阻止肌膜上钙离子通道和肌浆网膜上钙离子通道磷酸化,从而阻止了钙离子从肌浆网中进入胞浆中,降低胞浆中的钙离子浓度,最终减低肌肉细胞的收缩作用,维持细胞的损伤修复,再生,抗疲劳等作用。
蒋伟[10]2003年在《P物质对成纤维细胞内源性生长因子的表达调控及其信号机制的研究》文中进行了进一步梳理随着神经免疫学的发展，人们逐渐认识到，创伤后由周围神经末梢释放的感觉神经肽，参与了伤口愈合的调控，其中P物质在伤口愈合过程中发挥了重要的作用。研究表明，P物质不仅参与了创伤后的神经源性炎症反应，引起毛细血管扩张、通透性增加，而且直接促进修复细胞的增殖和迁移，并且通过与炎性细胞的相互作用，调节这些细胞的功能，诱导细胞因子和生长因子的释放，从而从多个方面参与伤口愈合的调控。但是，SP与伤口局部组织精细的作用过程和作用机制如何？SP与调控伤口愈合的细胞因子网络系统的关系如何？SP作用的信号转导机制是什么？等等，对这些重要问题目前仍知之甚少。因此，有必要进行更加深入的研究，以探讨改善神经功能和调节神经肽分泌可否促进伤口愈合。本课题组前期在体实验结果显示，SP能促进大鼠伤口愈合，并与伤口局部组织中生长因子EGF和bFGF呈同步化表达，提示SP的促愈合作用可能与其诱导成纤维细胞和内皮细胞内源性生长因子的表达有关。为进一步验证这一假想，更加深入地了解SP在创伤愈合中的重要作用、创伤愈合过程中生长因子网络调控的特点、SP对生长因子表达调控作用及其信号转导机制，本研究在对大鼠肉芽组织成纤维细胞进行体外原代培养的基础上，采用MTT法研究了SP对成纤维细胞增殖的影响；采用RT-PCR和Western Blot方法从基因和蛋白质水平研究了SP对成纤维细胞内源性生长因子表达的调控作用；并以转录调控为中心，采用EMSA方法研究了SP对成纤维细胞核因子-κB(NF-κB)的激活作用，并探讨了其信号转导机制；采用转录因子圈套技术研究了NF-κB在SP调控生长因子表达中的作用。主要结果和结论如下：1. SP在体外对大鼠肉芽组织成纤维细胞具有显着的促增殖作用，且表现出明显的剂量依赖的特性，这一作用可能与其诱导EGF和bFGF的表达有关；2. SP可诱导大鼠肉芽组织成纤维细胞内源性EGF和bFGF基因和蛋白的表达，并呈现出一定的剂量和时间特征；3. SP可剂量依赖性地激活NF-κB，这一作用是通过NK-1受体介导的，细胞内Ca2+ 信号的激活、以及氧自由基的形成是其中重要的第二信使，而与PKC无关；使用NF-κB硫代寡核苷酸圈套能明显抑制SP对肉芽组织成纤维细胞bFGF的
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