高效氯氰菊酯胁迫下冈田绕眼果蝇CYP450基因表达特征研究

论文摘要

目的:通过高效氯氰菊酯胁迫遵义地区冈田绕眼果蝇（Phortica okadai,P.okadai）,研究其细胞色素P450（cytochrome P450,CYP450）基因的表达特征,为媒介昆虫对菊酯类杀虫剂的代谢抗性机制研究奠定基础。方法:1.建立P.okadai动物模型:在遵义周边地区诱捕P.okadai,形态学初步鉴定后进行实验室饲养,进一步通过体视镜、扫描电镜等对其卵、幼虫、蛹、成虫四个阶段进行形态学研究,并利用细胞色素C氧化酶亚基1（cytochrome c oxidase subunit 1,cox1）基因进行分子鉴定。2.高效氯氰菊酯胁迫下P.okadai的毒力测定:参照GB/T26350-2010版《蝇类抗药性检测方法家蝇生物测定法》,通过药膜法检测高效氯氰菊酯对P.okadai（实验室饲养未接触任何杀虫剂、羽化3-5 d未交尾的雌蝇）的毒力。3.内参基因筛选:结合课题组前期构建的转录组数据库,挑选18S RNA、EF-1α、GAPDH、β-Actin和β-Tublin五个候选内参基因,通过荧光定量PCR检测,结合△Ct值分析、GeNorm软件分析、NormFinder软件分析和BestKeeper分析四种方法,确定P.okadai在高效氯氰菊酯胁迫下表达稳定的内参基因。4.结合课题组前期构建的转录组数据库,挑选四个与对菊酯类杀虫剂代谢抗性相关的CYP450基因,以筛选到的β-Tublin基因作为内参基因,通过荧光定量PCR分析候选CYP450基因在高效氯氰菊酯LC20（0.061mg/L）胁迫下七个时间点（0、1、2、4、8、12、24 h）的表达差异。5.高效氯氰菊酯胁迫下P.okadai CYP450酶系基因表达差异研究:通过转录组测序比较P.okadai在高效氯氰菊酯作用0 h和1 h CYP450酶系基因的表达差异,并挑选部分CYP450基因进行荧光定量PCR验证。结果:1.遵义地区P.okadai与中国安徽等其他地区P.okadai形态学上无明显差异,二者cox1基因序列一致性为100%;与欧美的变色伏绕眼果蝇（Phortica variegata,P.variegata）形态学上无明显差异,与意大利P.variegata的cox1基因序列一致性为98%。2.毒力回归计算结果表明,高效氯氰菊酯作用于P.okadai的LC20为0.061 mg/L。3.荧光定量PCR结果显示,五个候选内参基因中,β-Tublin基因是高效氯氰菊酯胁迫研究的最适内参基因。4.荧光定量PCR结果表明,四个CYP450基因均在胁迫1 h时就出现显著表达差异（P<0.05）,其中cyp9f2基因表达显著升高,其他三个基因表达显著降低。5.转录组测序分析显示高效氯氰菊酯胁迫P.okadai 1 h时,差异表达的CYP450基因有103个。以差异倍数|log2Ratio|≥1和q值<0.05为标准,筛选出差异表达的CYP450基因有21个,其中表达上调基因5个,表达下调基因16个;荧光定量PCR验证结果与转录组测序结果一致。结论:1.遵义地区P.okadai与P.variegata形态学上一致,但基于cox1基因进行系统进化分析显示二者存在一定差异。2.高效氯氰菊酯胁迫下P.okadai的LC20为0.061 mg/L,表达稳定的内参基因是β-Tublin基因。3.低浓度高效氯氰菊酯胁迫1 h以内,P.okadai对杀虫剂的代谢可能与cyp28d1、cyp28d2、cyp4d2以及cyp49a1等CYP450基因表达上调相关。

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王灵军

导师: 于红松,刘晖

关键词: 冈田绕眼果蝇,高效氯氰菊酯,基因,转录组测序

来源: 遵义医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 遵义医科大学

基金: 国家自然科学基金(81560336,81760373),贵州省科技计划项目(黔科合基础[2016]1168)

分类号: R384.2

总页数: 70

文件大小: 4055K

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