抗PEDV单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

论文摘要

猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）感染猪引起的肠道传染性疾病。患病仔猪主要临床特征为呕吐,腹泻,严重脱水等症状。近几年该病在我国的流行范围明显扩大,病原致病性亦有增强趋势,是当前仔猪腹泻死亡的重要病因之一。临床表现上,猪流行性腹泻与其他猪病毒性腹泻病临床症状上极为相似,因此,需要进行实验室鉴别诊断。其中ELISA特异性强,灵敏度高,可批量化检测,对本病病原检测具有重要价值。为获得ELISA主要检测试剂,本研究制备了抗PEDV单克隆抗体。以Vero细胞繁殖PEDV,将病毒培养物梯度密度离心纯化后,免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、克隆和多次筛选获得了三株稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为43B6-H2,75E2-F3,27C9-C5-D8。三株单克隆抗体经亚型鉴定均为Ig M亚型;间接ELISA测定杂交瘤细胞上清液抗体效价分别为1:6400;1:3200;1:3200;Western blot结果显示,三株单克隆抗体均能特异性与PEDV结构蛋白发生反应,但反应发生的结构蛋白大小不同,43B6-H2和75E2-F3识别相同分子大小的蛋白,在25-35KD之间。27C9-C5-D8识别约55KD蛋白,分别应对应于PEDV M蛋白和N蛋白,对三株单克隆抗体进行的叠加ELISA结果也表明,43B6-H2和75E2-F3识别同一个抗原表位,而27C9-C5-D8识别不同的抗原位点;间接免疫荧光结果表明,三株单克隆抗体与感染PEDV的Vero细胞反应,均能产生特异性荧光信号,而与感染猪传染性胃肠炎病毒的细胞不发生反应;综上所述,所制备的三株单克隆抗体对PEDV具有良好的特异性,为PED病原的诊断提供了重要的物质基础。在PEDV单克隆抗体制备的基础上,利用纯化的兔抗PEDV血清作为捕获抗体,过氧化物酶标记的单克隆抗体为检测试剂,通过各项条件的优化,建立了双抗体夹心ELISA检测PEDV主要反应条件:即将兔抗PEDV多抗稀释为浓度为2.8μg/m L,每孔加入100μL,37℃包被1 h之后包被过夜,取出后,用洗板机洗板3次,每次每孔加入200μL的1×磷酸盐吐温缓冲液洗涤5 min;然后加入5%脱脂乳200μL/孔封闭过夜,取出后,用洗板机洗板3次,每次每孔加入200μL的1×磷酸盐吐温缓冲液洗涤5 min,之后加入病毒培养物200μL,或者用磷酸盐缓冲液等比稀释的粪便样品200μL,37℃作用90min,甩去样品液,用洗板机洗板3次,每次每孔加入200μL的1×磷酸盐吐温缓冲液洗涤,每次5 min,加入浓度为7.5μg/m L的酶标记单抗,每孔加入100μL,37℃条件作用90 min,用洗板机洗板3次,每次每孔加入200μL的1×磷酸盐吐温缓冲液洗涤,每次5 min,每孔加入100μL的TMB显色液工作液,37℃避光显色10 min后,每孔加入50μL终止液,终止显色,OD450nm测定。本检测方法不与猪传染性胃肠炎（TGE）,猪轮状病毒（Po RV）,发生交叉反应;其病毒最低检测限度为3.125×103TCID50/m L;板内阳性样品变异系数为1.22%-3.66%,板内阴性样品变异系数为2.90%-8.72%;板间阳性变异系数为3.76%-7.03%,板间阴性样品变异系数为3.62%-9.32%,所有变异系数均小于10%。通过对47份病料的初步检测并与RT-PCR方法和金标免疫层析试纸条检测结果进行对比,检测结果显示,RT-PCR检测为阴性的样品,双抗体夹心ELISA和金标免疫层析试纸条检测也均为阴性;RT-PCR方法检测出的21份阳性样品,双抗体夹心ELISA共检测出19份阳性样品,金标免疫层析试纸条共检测只有14份阳性样品。从结果看,本方法的阳性检出率是介于RT-PCR和金标免疫层析试纸条之间。

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摘要

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1 前言

1.1 PED流行特征及其危害

1.2 PEDV病原学特征

1.2.1 PEDV的形态特征和主要理化特性

1.2.2 PEDV核酸结构

1.2.3 PEDV的结构蛋白

1.2.4 PEDV的培养特性

1.3 PED的诊断

1.3.1 PED的临床诊断

1.3.2 PED特异性诊断

1.4 单克隆抗体在疾病诊断方面的应用

1.5 研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 细胞与病毒

2.1.2 实验动物

2.1.3 临床粪便样品

2.1.4 抗体制剂

2.1.5 主要试剂

2.1.6 主要试剂配制

2.1.7 主要仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 免疫原的制备

2.2.2 实验动物免疫

2.2.3 杂交瘤筛选方法的建立

2.2.4 分泌PEDV抗体阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆

2.2.5 单克隆抗体效价的测定

2.2.6 单克隆抗体的特征性鉴定

2.2.7 双抗体夹心ELISA方法的建立

2.2.8 双抗体夹心ELISA方法的优化

2.2.9 双抗体夹心ELISA方法的灵敏性试验

2.2.10 双抗体夹心ELISA方法的特异性试验

2.2.11 双抗体夹心ELISA方法的重复性试验

2.2.12 双抗体夹心ELISA方法检测临床样品

3 结果

3.1 PEDV的增殖及鉴定

3.1.1 PEDV的增殖

3.1.2 PEDV-Px株 TCID50 的测定

3.1.3 PEDV的纯化

3.2 杂交瘤细胞株筛选ELISA的建立

3.3 分泌抗PEDV抗体的杂交瘤细胞株筛选结果

3.4 单克隆抗体效价的测定

3.5 单克隆抗体特性鉴定

3.5.1 单克隆抗体亚型的鉴定

3.5.2 杂交瘤细胞分泌单克隆抗体稳定性的鉴定结果

3.5.3 Western blot鉴定及结合表位分析

3.5.4 IFA鉴定

3.5.5 单克隆抗体特异性的鉴定

3.6 双抗体夹心ELISA方法的建立

3.6.1 抗体的纯化鉴定及HRP标记浓度的确定

3.6.2 兔抗PEDV多抗与单克隆抗体适宜工作浓度的确定

3.6.3 双抗体夹心ELISA各条件测定

3.6.4 双抗体夹心ELISA方法灵敏性测定

3.6.5 双抗体夹心ELISA检测PEDV的特异性

3.6.6 双抗体夹心ELISA检测PEDV重复性结果

3.6.7 临床样品的检测

4 讨论

4.1 制备的单克隆抗体主要特性

4.2 PEDV抗原检测双抗体夹心ELISA的建立和优化

4.3 双抗体夹心ELISA对临床样本的检测

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 马宇聪

导师: 李一经

关键词: 猪流行性腹泻病毒,单克隆抗体,双抗体夹心

来源: 东北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 东北农业大学

分类号: S852.4

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抗PEDV单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

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