菊糖蔗糖酶和β-半乳糖苷酶的鉴定及其性质研究

论文摘要

果聚糖是广泛应用于食品、保健品和制药工业中的功能性多糖。目前,获得果聚糖的方法有两种,一种是植物来源,另一种是微生物来源的酶直接合成。细菌来源的合成果聚糖的酶有两种,菊糖蔗糖酶（EC 2.4.1.9）和果聚糖蔗糖酶（EC 2.4.1.10）。其中,菊糖蔗糖酶的研究很少,酶学特性和晶体结构信息都不是很清楚。为了获得催化效率较好的菊糖蔗糖酶,本文从CAZy数据库中筛选了一段来源于Brevibacillus formosus的糖苷水解酶。通过对B.formosus来源的糖苷水解酶序列进行分析,该序列与Bacillus korlensis（WP0660521 62.1）来源的果聚糖蔗糖酶相似性为78.55%,与Bacillus agaradhaerens WDG185（ATN45518.1）来源的菊糖蔗糖酶的相似性为72.01%,将其命名为Inu-Bfor。通过大肠杆菌表达系统获得了高表达量的可溶性蛋白（蛋白含量约为1.5 mg/mL）,并进行了酶学性质的研究。Inu-Bfor最适温度为35℃,具有极好的热稳定性,45℃条件下的半衰期为34 h。最适pH为6.0,pH5.0条件下,148 h后仍然保留80%的酶活力,pH7.0的条件下半衰期为100 h,表明Inu-Bfor在中酸性条件下pH稳定性极好。Inu-B for只水解含果糖分子与葡萄糖分子以β-（1-2）糖苷键连接的底物。除SDS能完全抑制Inu-Bfor的酶活外,金属离子和其他化学试剂对Inu-Bfor表现出不同程度的促进和抑制作用。高浓度的蔗糖有利于Inu-B for合成果聚糖,反应8 h后果聚糖合成量达到最大值7 mg/mL。由NMR、HPLC和FTIR验证了Inu-Bfor合成的果聚糖为菊糖型果聚糖。由此,表明Inu-Bfor是具有广泛应用潜景的菊糖蔗糖酶。β-半乳糖苷酶（EC 3.2.2.23）能将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,是一种重要的工业化酶。商业化的β-半乳糖苷酶主要有两种,一种是黑曲霉来源于的β-半乳糖苷酶,另一种是酵母菌来源的β-半乳糖苷酶。商业化的β-半乳糖苷酶主要应用领域是牛奶中乳糖的水解,而牛奶的pH为中性。市场中又缺乏同时在中性pH左右和高温条件下的β-半乳糖苷酶。而细菌来源的高温β-半乳糖苷酶可以高温催化牛奶中的乳糖,并能防止牛奶被杂菌污染。为了获得高温的催化效率好的β-半乳糖苷酶,本文从CAZy数据库中筛选了一段来源于Truepera radiovictrix的糖苷水解酶。通过对T.radiovictrix来源的糖苷水解酶序列进行分析,该序列与Synthetic construct（API85502.1）来源的GH1家族糖苷水解酶相似性为61.22%,与Thermus thermophilus（AAS82372.1）来源的β-半乳糖苷酶相似性为57%,具有典型的β-半乳糖苷酶域,将其命名为BgalT。通过大肠杆菌表达系统获得了可溶性蛋白,并进行了酶学性质研究。BgalT最适温度为65℃,它的热稳定性很好,65℃条件下的半衰期为2 h。最适pH为6.5,在pH 4.0-9.0之间,随着pH值的增大,其稳定性越来越好。BagIT具有广泛的底物特异性。除5 mM Cd2+和10 mM SDS能完全抑制酶活外,其他金属离子对BgalT表现不同程度的促进和抑制作用,BgalT对化学试剂表现出一定的耐受性。高浓度的有机试剂、葡萄糖和半乳糖都能抑制BgalT的酶活。BgalT的比酶活高达878.6土14.6 U/mg,以oNPG为底物时,Km=6.24 mM,Kcat=1657.2 S-1,Kcat/Km=65.6 sS-1mM-1,以乳糖作为底物时,Km=288.5 mM,Kcat=22.7 S-1,Kcat/K =0.08 S-1 mM-1。与已报道的细菌来源的β-半乳糖苷酶相比,BgalT在55℃,1.8 U/mL的酶量时,仅5h就能完全水解脱脂牛奶中的乳糖,表明BgalT具有很高的催化效率。

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摘要

Abstract

缩略词表

第一章绪论

1.1 果聚糖的合成、菊糖蔗糖酶和果聚糖蔗糖酶

1.1.1 果聚糖的合成

1.1.2 菊糖蔗糖酶

1.1.3 果聚糖蔗糖酶

1.2 Brevibacillus formosus

1.3 β-半乳糖苷酶

1.3.1 β-半乳糖苷酶的来源和家族分类

1.3.2 β-半乳糖苷酶的催化特性和生物学特性

1.3.3 高温β-半乳糖苷酶的应用优势

1.4 Truepera radiovictrix

1.5 本研究的目的、意义和主要研究内容

第二章 Brevibacillus formosus的菊糖蔗糖酶表达纯化、鉴定和酶学性质的研究

2.1 实验材料

2.1.1 质粒和菌株

2.1.2 常用酶和试剂

2.1.3 主要实验仪器

2.1.4 培养基和主要试剂的配制

2.2 实验方法

2.2.1 菊糖蔗糖酶Inu-B for的氨基酸序列分析

2.2.2 菊糖蔗糖酶Inu-B for的克隆表达

2.2.3 菊糖蔗糖酶Inu-Bfor的酶学性质研究

2.2.4 菊糖蔗糖酶Inu-B for合成产物条件的优化

2.2.5 菊糖蔗糖酶Inu-B for产物的分离和鉴定

2.3 实验结果与讨论

2.3.1 菊糖蔗糖酶Inu-B for的序列分析

2.3.2 菊糖蔗糖酶Inu-B for的克隆表达

2.3.3 菊糖蔗糖酶Inu-Bfor的酶学性质研究

2.3.4 菊糖蔗糖酶Inu-Bfor合成产物条件的优化

2.3.5 菊糖蔗糖酶Inu-Bfor产物的分离和鉴定

2.4 本章小结

第三章 Truepera radiovictrix的β-半乳糖苷酶的表达纯化、酶学性质和牛奶中乳糖水解的研究

3.1 实验材料

3.1.1 质粒和菌株

3.1.2 常用酶和试剂

3.1.3 主要实验仪器

3.1.4 培养基和主要试剂的配制

3.2 实验方法

3.2.1 β-半乳糖苷酶BgalT的氨基酸序列分析

3.2.2 β-半乳糖苷酶BgalT的克隆表达

3.2.3 β-半乳糖苷酶BgalT的酶学性质研究

3.2.4 脱脂牛奶中β-半乳糖苷酶BgalT酶解条件的优化

3.3 实验结果与讨论

3.3.1 β-半乳糖苷酶BgalT氨基酸序列分析

3.3.2 β-半乳糖苷酶BgalT的克隆和表达

3.3.3 β-半乳糖苷酶BgalT的酶学性质研究

3.3.4 脱脂牛奶中β-半乳糖苷酶BgalT酶解条件的优化

3.4 本章小结

结论与展望

参考文献

附图

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 翟璐

导师: 彭惠

关键词: 果聚糖,菊糖蔗糖酶,半乳糖苷酶,酶学性质

来源: 安徽大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 安徽大学

基金: 国家自然科学基金

分类号: Q55

总页数: 83

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