禽致病性大肠杆菌aroA基因缺失株的构建及雏鹅免疫保护作用试验

论文摘要

禽致病性大肠杆菌（Avianpathogenic Escherichia coli,APEC）是引起鹅大肠杆菌病的重要病原菌之一,可导致雏鹅的大肠杆菌性败血症,成年鹅卵黄性腹膜炎,严重危害养禽业的健康发展。由于细菌耐药性问题日益突出,疫苗免疫接种是预防和控制鹅大肠杆菌病的较为理想方案,而目前尚无商品化疫苗。糖酵解是细菌体内基础代谢之一,aroA基因编码的3-磷酸烯醇丙酮酰基莽草酸-5-磷酸合成酶（EPSPS）,是细菌糖酵解中间产物莽草酸代谢途径关键酶,为细菌体内生存所必须。前期有研究将病原细菌aroA基因敲除作为疫苗使用,取得良好效果。本研究利用λ-Red同源重组技术构建鹅源致病性大肠杆菌aroA基因缺失株,在探索其生物学特性和致病力基础上,评估该基因缺失菌株作为疫苗候选株的潜力。具体研究内容如下:（1）根据GenBank上所登录的APEC aroA基因序列,设计一对引物,用以PCR扩增APEC临床分离株G8107菌株aroA基因和序列鉴定。进一步根据此试验菌株aroA序列设计一对λ-Red同源重组系统试验用缺失引物,其5’端与aroA序列两侧同源,而3’端与氯霉素抗性基因cat表达盒同源。基于λ-Red同源重组系统,以质粒pKD3为模板扩增出的含有氯霉素抗性的PCR产物,经纯化后,导入含有质粒pKD46的G8107菌株,在Red同源重组酶的作用下,氯霉素抗性基因片段借助两翼同源序列与染色体上的靶基因发生重组,将aroA基因置换下来,通过氯霉素抗性筛选平板筛选阳性重组子,即获得一次重组菌。在二次重组中,一次重组菌电转化导入编码Flp重组酶的质粒pCP20,通过对cat阅读框两侧的FRT位点的识别,从而消除抗性基因。最后通过PCR特异性检测以及DNA测序结果,验证G8107△aroA缺失株的成功构建。将携带编码有aroA基因全长的表达重组质粒pBR322-aroA导入缺失株构建回补株G8107△aroA/pararoA。（2）进一步分析G8107△aroA基因缺失株的生物学特性和致病力。相关生物学特性研究结果表明,缺失株分解发酵糖类和氨基酸的能力以及运动能力与野生株没有差异;缺失株在对数生长期的生长速度慢于野生株,稳定期趋于同一水平;体外黏附试验结果表明,相比于野生株,G8107AaroA缺失株对鸡成纤维细胞系DF-1的黏附能力下降35%（p<0.01）;体外生物被膜定量试验结果表明,与野生株相比,缺失株生物被膜形成能力降低72%（p<0.01）;通过qRT-PCR试验检测aroA基因缺失株中相关毒力因子表达情况。结果表明,与野生株相比,缺失株中表达溶血素亚单位的hlyA基因表达量下降2%（p>0.05）,编码血清抗性蛋白的iss基因表达量下降11.0%（p>0.05）,编码温敏性血凝素tsh基因表达量下降8.3%（p>0.05）,而回补株在上述参数指标均得到了部分恢复。（3）G8107AaroA缺失株感染雏鹅致病力分析和免疫效果初步评测。为进一步探究△aroA缺失株致病性能力,建立2日龄雏鹅感染试验模型:分别将G8107野生株、△aroA缺失株、△aroA/paroA回补株经翅下注射107、108、109 cfu/mL菌液0.5 mL感染雏鹅,通过改良寇氏法计算得出G8107野生株、△aroA缺失株和△aroA/paroA回补株的LD50分别为 5.96×108cfu、23.7×108cfu和 16.8×108cfu。△aroA缺失株 LD50 是野生株的 3.98 倍,表明aroA基因缺失能够显著降低大肠杆菌毒力。为进一步评价G8107△aroA减毒株对雏鹅感染的免疫保护效果,建立雏鹅攻毒免疫保护试验模型。将50只7日龄雏鹅随机分成A、B、C、D和E五组,每组各10只。C、D、E组分别以口服免疫108、109、1010 cfu/mL G8107△aroA减毒株菌液,B组口服等量PBS,A组为空白对照组,免疫剂量均为0.5 mL/只。2周后采用同样的剂量和途径进行二次免疫。二免2周后以1010cfu/mL进行APEC野生株气囊攻毒0.5 mL菌液,于攻毒后第10天处死剩余鹅并进行病理剖检。免疫保护试验结果显示:免疫G8107△aroA的C、D、E三组攻毒后出现死亡鹅只数分别为4、2、2,而免疫PBS的B组死亡只数为8;相比于B组,C、D、E三组雏鹅死亡率分别下降40%、60%、60%。剖检诊断与显微病理学检查结果显示,G8107△aroA减毒株三个免疫组较PBS免疫组的组织器官病变明显减轻。以上结果证明免疫G8107△aroA重组减毒株对雏鹅APEC感染具有较好的保护效果。综上,本研究成功构建了鹅源大肠杆菌aroA基因缺失菌株,并对其生物学特进行研究,证实了 aroA基因缺失能够引起菌株毒力的显著下降,评估了 aroA基因缺失菌株作为疫苗候选株的潜力。

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中文摘要

Abstract

符号说明

第一篇文献综述

综述一鹅大肠杆菌病的概述

1. 流行病学

2. 临床症状及病理变化

2.1 鹅大肠杆菌败血病

2.2 鹅大肠杆菌性生殖器官病

3. 诊断

3.1 微生物学检验

3.2 血清学检验

4. 预防措施

5. 治疗方案

综述二染色体-质粒平衡致死系统研究进展

1. 染色体-质粒平衡致死系统基本原理

2. 营养缺陷标志基因

2.1 asd基因

2.2 thyA基因

2.3 aroA基因

2.4 cya/crp基因

2.5 hok/sok基因

2.6 phoP/phoQ基因

3. 染色体-质粒平衡致死系统

3.1 缺陷型菌株的构建方法

3.2 互补质粒的构建

3.3 染色体-质粒平衡致死系统的应用

综述三基因工程疫苗研究进展

1. 减毒致病菌活载体疫苗

1.1 减毒沙门氏菌活载体疫苗

1.2 减毒李斯特氏菌活载体疫苗

2. 非致病菌活载体疫苗

3. 总结与展望

参考文献

第二篇试验研究

第一章禽致病性大肠杆菌G8107△aroA基因缺失株的构建

1. 材料

1.1 菌株和质粒

1.2 培养基和主要试剂

1.3 主要仪器

2. 方法

2.1 一次同源重组菌的构建

2.2 二次重组菌构建

2.3 回补株的构建

3. 结果

3.1 融合PCR产物的制备

3.2 第一次重组菌G8107△aroA::cat的PCR鉴定

3.3 第二次重组菌G8107△aroA的鉴定

3.4 对APEC G8107△aroA菌株基因组序列分析

3.5 回补质粒的鉴定

4. 讨论

参考文献

第二章 APEC G8107△aroA基因缺失株的生物学特性分析

1. 材料

1.1 菌株及细胞系

1.2 主要试剂与配制

1.3 仪器设备

2. 方法

2.1 细菌生化试验

2.2 生长曲线的测定

2.3 运动性试验

2.4 DF-1细胞黏附试验

2.5 qRT-PCR试验

2.6 生物被膜试验

3. 结果

3.1 细菌生化试验结果

3.2 细菌生长曲线测定

3.3 运动性试验结果

3.4 黏附试验结果

3.5 qRT-PCR试验结果

3.6 aroA对G8107生物被膜形成试验

4. 讨论

参考文献

第三章 APEC G8107△aroA基因缺失株对雏鹅毒力保护试验

1. 材料

1.1 菌株与试验动物

1.2 试剂与仪器

1.3 细菌培养计数

2. 方法

2.1 大肠杆菌雏鹅LD50测定

2.2 大肠杆菌在雏鹅体内组织中生长测定

2.3 G8107△aroA减毒株对雏鹅的毒力保护试验

2.4 数据统计

3. 结果

3.1 大肠杆菌对雏鹅LD50测定

3.2 雏鹅体重变化结果

3.3 大肠杆菌在雏鹅体内组织中生长测定结果

3.4 减毒株对雏鹅的毒力保护试验结果

3.5 组织病理学变化

4. 讨论

参考文献

全文小结

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 宋浩亮

导师: 朱国强,李玉和

关键词: 禽致病性大肠杆菌,基因,同源重组系统,雏鹅,免疫保护力

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 牛羊重要疫病诊断与检测新技术研究(科技部畜禽重大疫病防控与高效安全养殖综合技术研发重点专项,编号2016YFD0500900,2016-2020,牛羊常见细菌病的诊断与检测新技术研究)

分类号: S852.61

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000625

总页数: 66

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禽致病性大肠杆菌aroA基因缺失株的构建及雏鹅免疫保护作用试验

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