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拟南芥快速运输沉默突变体imos1基因的克隆

2020-12-09阅读(359)

拟南芥快速运输沉默突变体imos1基因的克隆

论文摘要

外源基因在转基因植物稳定表达,是改变农艺性状和胁迫抗性的重要手段之一。但是在成功导入并且结构完整的情况下,仍会出现基因不能表达或者表达效率低下的问题,这种现象常常与基因沉默机制相关。其中RNA水平基因调控的基因沉默现象普遍存在,有研究表明韧皮部从源到各个库运输同化物同时也运输一些如m RNA与小RNA等生物大分子,且m RNA介导的基因沉默可以在细胞与细胞间传递,也可以进行从根到芽的长距离传递。目前对于基因沉默的长距离运输机制仍不甚明了,本试验立足基因沉默的长距离运输可以稳定遗传的拟南芥突变体,筛选与沉默速率相关基因并进行功能验证。本研究的主要结果如下:1)本实验利用基于EMS处理转基因Rt SS材料得到的沉默速率不同的可稳定遗传突变体材料imos1和GS6杂交构建F3代基因混合池,通过全基因组测序与WT比对分析差异SNP,得到9个候选基因:AT1G32230,AT1G47560,AT1G62580,AT3G09405,AT4G28050,AT4G30170,AT5G45960,AT5G56470,AT5G59740。2)基于前人研究基础,构建CRISPR/Cas系统p Cas Kana,该系统植物筛选为Kana抗性并且可通过显微镜直接观察荧光蛋白筛选无CRISPR/Cas结构突变体。构建CRISPR/Cas系统p KEE401E-m Cherry,该系统以EC1.2-1.1作为融合启动子,并插入筛选蛋白m Cherry,为易于观察且在T1代纯合突变体高的双元载体。3)成功将9个候选基因构建到质粒p HDE-35S-Cas9-m Cherry-UBQ上,完成侵染并得到T0代种子,其中五个基因AT1G32230,AT1G47560,AT5G45960,AT5G56470,AT5G59740抗性培养基筛选分别得到3株,24株,6株,31株,6株T0代阳性植株,从对编辑AT1G47560的阳性植株中选取8株进行PCR并测序,并未发现突变。将AT1G32230与其同源基因AT2G35510构建到质粒p KEE401,经转基因获得T0代,筛选得到13株抗性苗,在表型观察时发现有3株出现明显变异,提取DNA,根据靶点附近设计特异性引物扩增,送样测序,比对结果,其中1号植株在两个位点均出现基因编辑。4)RCI3基因与沉默信号的运输速率有关,根据此基因的CDS序列设计引物构建原核表达载体p DEST15-RCI3,经测序确定插入片段正确;利用IPTG诱导,未得到符合预计的蛋白片段,经多试验与对RCI3基因进行蛋白结构预测,分析后又进行分段表达,去除跨膜结构等操作,但是效果依然不理想,初步判断此基因不适合原核表达。5)本实验在成功构建入门载体的情况下,利用Gateway技术构建钓饵载体p DEST32-RCI3,为通过酵母双杂交系统筛选出与其相互作用的蛋白从而为研究基因的作用机制及功能奠定基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略词表（Abbreviation）
  • 第1章 绪论
  •   1.1 基因沉默的发现及分类
  •   1.2 基因沉默在植物中的应用
  •   1.3 基因沉默在植物中的运输
  •   1.4 基因沉默运输相关基因的研究
  •   1.5 基因编辑技术的发展
  •   1.6 CRISPR/Cas9技术在植物中的应用
  •   1.7 目的与意义
  • 第2章 利用突变体imos1筛选候选基因
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 技术路线
  •     2.2.2 植物材料与培养
  •     2.2.3 主要仪器设备
  •     2.2.4 基因混合池的构建
  •     2.2.5 简易法提取植物DNA
  •   2.3 结果与分析
  • 1代筛选'>    2.3.1 杂交F1代筛选
  • 2、F3代筛选'>    2.3.2 杂交F2、F3代筛选
  • 3代沉默观察'>    2.3.3 杂交F3代沉默观察
  •     2.3.4 比对分析差异SNP
  • 第3章 靶向候选基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验方法与步骤
  •     3.2.1 实验材料
  •     3.2.2 实验步骤
  •   3.3 结果与分析
  •     3.3.1 RGR表达盒的合成
  •     3.3.2 RGR与pHDE-35S-Cas9-mCherry-UBQ质粒的连接与鉴定
  •     3.3.3 改造质粒pCaskana的鉴定
  •     3.3.4 2sgRNA表达盒的构建
  •     3.3.5 2sgRNA与pKEE401质粒的连接与鉴定
  •     3.3.6 pKEE401E-mCherry质粒的构建
  • 0代的筛选'>    3.3.7 转基因拟南芥T0代的筛选
  •   3.4 讨论
  •     3.4.1 pHDE-35S-Cas9-mCherry-UBQ的改造
  •     3.4.2 pKEE401的改造
  •     3.4.3 基于SNP筛选的候选基因的功能鉴定
  • 第4章 拟南芥RCI3基因的原核表达
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验材料
  •     4.2.1 实验植株
  •     4.2.2 实验菌株和质粒
  •   4.3 实验方法与步骤
  •     4.3.1 植物材的种植
  •     4.3.2 RNA的提取
  •     4.3.3 样品RNA的质量检测
  •     4.3.4 cDNA第一链的合成
  •     4.3.5 RCI3基因的PCR扩增
  •     4.3.6 载体构建
  •     4.3.7 重组质粒检测
  •     4.3.8 SDS-PAGE胶及蛋白样品制备
  •   4.4 结果与分析
  •     4.4.1 拟南芥总RNA的提取检测
  •     4.4.2 拟南芥RCI3基因的克隆
  •     4.4.3 目的基因原核表达载体的构建与鉴定
  •     4.4.4 RCI3融合蛋白的诱导表达
  •   4.5 讨论
  • 第5章 钓饵载体的构建
  •   5.1 引言
  •   5.2 实验方法与步骤
  •     5.2.1 pDEST32-Rci3重组质粒的构建
  •     5.2.2 连接产物的转化和重组质粒的提取
  •     5.2.3 重组质粒的测序
  •   5.3 结果与分析
  •     5.3.1 pDEST32-Rci3重组子的PCR鉴定与酶切鉴定
  •     5.3.2 pDEST32-Rci3的测序结果
  •   5.4 讨论
  • 第6章 总结与展望
  •   6.1 总结
  •   6.2 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录A
  • 个人简介

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 蒋梦婷

    导师: 梁大成,王谧

    关键词: 基因沉默,原核表达,酵母双杂交

    来源: 长江大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 长江大学

    分类号: Q943.2

    总页数: 74

    文件大小: 2009K

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