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大肠杆菌漆酶前导肽与连接区域对其功能影响的初步研究

2020-12-08阅读(949)

大肠杆菌漆酶前导肽与连接区域对其功能影响的初步研究

论文摘要

漆酶（EC 1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶。它对芳香族化合物、甾体激素和生物色素等具有广泛的催化特异性。统计发现,它可以催化氧化大约三百余种不同类型的底物,在家具装饰、低污染纺织、纸张脱色、生活洗涤和食品饮料等一系列行业中都具有巨大的应用潜力。近年来,对漆酶的研究日益受到重视。漆酶的来源非常广泛,大致可分为植物漆酶、昆虫漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶。其中,细菌漆酶相对于其他漆酶,具有来源广、生长周期短、热稳定性好、pH范围宽等优势。而大肠杆菌（Escherichia coli）漆酶作为一种重要的细菌漆酶,针对其研究的文献报道也越来越多。虽然已有部分文献对E.coli漆酶进行过相关研究,但针对其自身信号肽、前导肽以及第三结构域对其功能的影响却未见报道;虽然针对E.coli漆酶和真菌漆酶结构差异部分的研究已有相关报道,但差异部分对其功能的影响却始终不明确。本研究以E.coli来源的漆酶CueO作为研究对象,首先实现了其在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的异源表达,并研究了表达产物的酶学特性。为阐明CueO自身信号肽、前导肽、第三结构域以及不同结构域间连接区段特有的“盖子”结构对其功能的影响,本研究通过部分缺失或替换等手段构建了相关的突变体,并对突变体表达产物进行了分析。为进一步提高突变基因的表达量,本研究参照P.pastoris密码子偏好性对突变基因进行了优化,并实现其异源高效表达。本研究的主要结果为:（1）克隆得到E.coli漆酶CueO,并在P.pastoris中实现胞外分泌表达。其最适底物为ABTS,最适反应pH为3.0,最适反应温度为45℃,最适反应时间为10 min,最适Cu2+离子为2.0 mM。在摇瓶发酵甲醇诱导72 h后,蛋白表达量最高为81.26 μg/mL,酶活最高为356.67 U/L。在常见的7种金属离子中,除了Mn2+离子对酶活没有影响,其他金属离子均会抑制CueO酶活。（2）通过对一系列的缺失突变体的研究,发现信号肽的缺失（CueO-△Sp）分别将CueO的蛋白表达量和酶活提高为250.29 μg/mL和1248.36 U/L,是野生型CueO的3.08倍和3.5倍;结构域间连接区段的缺失虽然提高了蛋白表达量,但导致CueO失活;前导肽的缺失阻碍了蛋白的分泌;无论对CueO结构域之间连接区段中的a-螺旋进行缺失或者替换,均会导致CueO的彻底失活。（3）通过参照P.pastoris密码子偏好性将去除信号肽的突变体CueO-△Sp进行优化,得到了 2条优化基因,并导入P.pastoris中实现异源表达。优化后基因的蛋白表达量和酶活均比优化前的突变体要高,且最高的蛋白表达量为450.19μg/mL,最高的酶活为2880.69 U/L,是优化前CueO-△Sp的1.8倍和2.3倍,是野生型CueO的5.54倍和8.07倍。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第1章 绪论
  •   1.1 漆酶的起源与分布
  •     1.1.1 植物漆酶
  •     1.1.2 昆虫漆酶
  •     1.1.3 真菌漆酶
  •     1.1.4 细菌漆酶
  •   1.2 漆酶的结构与作用机理
  •     1.2.1 真菌漆酶结构
  •     1.2.2 细菌漆酶结构
  •     1.2.3 漆酶的催化反应机理
  •   1.3 漆酶的应用
  •     1.3.1 环境保护及生物脱色
  •     1.3.2 食品工业
  •     1.3.3 造纸工业
  •     1.3.4 其他领域
  •   1.4 漆酶的异源表达
  •   1.5 E. coli漆酶CueO的分子改造
  •   1.6 本研究的目的及意义
  • 第2章 E.coli漆酶CueO的异源表达及产物分析
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌株和质粒
  •     2.1.2 实验仪器
  •     2.1.3 试剂耗材
  •     2.1.4 培养基及溶液
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 引物设计及CueO基因的获得
  •     2.2.2 pMD19-T-CueO质粒的构建
  •     2.2.3 pPICZαA-CueO表达载体的构建
  •     2.2.4 重组酵母工程菌株的构建与筛选
  •     2.2.5 重组酵母菌的摇瓶发酵及产物分析
  •   2.3 实验结果与分析
  •     2.3.1 CueO基因的获得及pMD19-T-CueO质粒的构建
  •     2.3.2 pPICZαA-CueO表达载体的构建
  •     2.3.3 重组酵母P.pastoris/CueO的摇瓶发酵及产物分析
  • 第3章 CueO的酶学特性研究
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 菌株和质粒
  •     3.1.2 实验仪器
  •     3.1.3 试剂耗材
  •     3.1.4 培养基及溶液
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 最适反应底物
  • 2+离子浓度'>    3.2.2 最适Cu2+离子浓度
  •     3.2.3 常见金属离子对CueO酶活的影响
  •   3.3 实验结果与分析
  •     3.3.1 最适反应底物
  • 2+离子浓度'>    3.3.2 最适Cu2+离子浓度
  •     3.3.3 常见金属离子对CueO酶活的影响
  • 第4章 CueO的分子改造
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 菌株和质粒
  •     4.1.2 实验仪器
  •     4.1.3 试剂耗材
  •     4.1.4 培养基及溶液
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 突变体引物设计
  •     4.2.2 针对CueO结构域的突变体构建
  •     4.2.3 针对CueO结构域之间连接区段的突变体构建
  •     4.2.4 突变体酵母的构建与筛选
  •     4.2.5 突变体酵母的摇瓶发酵及产物分析
  •   4.3 实验结果与分析
  •     4.3.1 CueO信号肽、前导肽及第三结构域突变体的构建
  •     4.3.2 CueO信号肽、前导肽及第三结构域突变体表达产物的分析
  •     4.3.3 CueO结构域之间连接区段突变体的构建
  •     4.3.4 CueO结构域之间连接区段突变体表达产物的分析
  • 第5章 CueO-△Sp的密码子优化
  •   5.1 实验材料
  •     5.1.1 菌株和质粒
  •     5.1.2 实验仪器
  •     5.1.3 试剂耗材
  •     5.1.4 培养基及溶液
  •   5.2 实验方法
  •     5.2.1 CueO-△Sp基因的密码子优化
  •     5.2.2 优化基因表达载体的构建
  •     5.2.3 优化基因重组酵母的构建与筛选
  •     5.2.4 优化基因重组酵母的摇瓶发酵及产物分析
  •   5.3 实验结果与分析
  •     5.3.1 密码子优化结果分析
  •     5.3.2 CueO-△Sp/WZ和CueO-△Sp/KR表达载体的构建
  •     5.3.3 CueO-△Sp/WZ和CueO-△Sp/KR重组酵母表达产物的分析
  • 第6章 结论与展望
  •   6.1 结论
  •   6.2 创新点
  •   6.3 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间的研究成果

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 周波

    导师: 杨江科

    关键词: 大肠杆菌,漆酶,毕赤酵母,前导肽,连接区段

    来源: 武汉轻工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 武汉轻工大学

    分类号: Q936;Q78

    DOI: 10.27776/d.cnki.gwhgy.2019.000230

    总页数: 66

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