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基于量子点标记检测狂犬病病毒G蛋白含量的荧光免疫吸附法的建立

2020-12-02阅读(776)

基于量子点标记检测狂犬病病毒G蛋白含量的荧光免疫吸附法的建立

论文摘要

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种感染几乎所有温血动物的中枢神经系统的人兽共患病,是至今为止人类病死率最高的急性传染病之一。狂犬病到目前为止仍没有特效治疗药物出现,现如今只能在被患病动物咬伤之后尽快暴露后免疫来预防狂犬病的感染。其中狂犬病病毒G蛋白是唯一一个诱导机体产生中和抗体的蛋白,在一定程度上可以认为疫苗中G蛋白的含量可以决定疫苗的保护效力。因此建立快速检测狂犬病病毒G蛋白含量的方法对于疫苗免疫效力的确定及免疫剂量的确定十分重要。酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）是一种广泛使用的免疫学检测方法,但是传统的ELISA仍具有灵敏度相对不足,检测成本高等缺点。而量子点以其优良的光谱特征和光化学稳定性在生命科学尤其是体外诊断中的应用越来越广泛,其中与ELISA结合的方法可以大大提高传统方法的灵敏度。本研究以ELISA作为基本分析方法,以狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体作为捕获抗体,以量子点标记的糖蛋白单克隆抗体作为检测抗体,建立荧光免疫吸附法（Fluorescence-linked immunosorbent assay,FLISA）来检测狂犬病病毒G蛋白含量,对于疫苗抗原含量的效价和免疫剂量的确定具有重要意义。1.狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体的制备与鉴定本研究成功获得3株抗狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体,分别命名为9F10,1F1和9G10。并对这3株抗体的特性进行鉴定,这3株单克隆抗体均为IgG类抗体,其中9F10和1F1为IgG2b,9G10为IgG2a,而轻链均为kappa。染色体检测结果9F10的染色体数目为90,1F1的染色体数目为89,9G10染色体数目为97。在间接免疫荧光实验中3株单克隆抗体均能特异性识别实验室狂犬病病毒固定毒株SAD、B2c,狂犬病病毒犬源野毒株DRV-Mexico、DRV-HuNPN01,DRV-AH08以及蝙蝠源野毒株SHBRV。在Western blot实验中,1F1、9F10和9G10均只能识别SAD。在抗原表位鉴定的Western blot实验中,结果显示9G10的抗原位点在239-339 aa之间,9F10与1F1的抗原位点在1-139 aa之间。2.狂犬病病毒G蛋白量子点荧光免疫吸附法FLISA检测方法的建立通过量子点偶联抗体前后表征实验,结果表明量子点偶联抗体之后能够正常的激发荧光,且荧光波长没有发生改变,凝胶电泳实验表明量子点已经成功修饰在抗体上。通过配对试验确定以9F10为捕获抗体,包被浓度为2μg/mL,以9G10与ZnCdSe/ZnS量子点偶联量子点并作为检测抗体,稀释度为1:200。用以上包被浓度和抗体稀释度进行反应条件优化。结果最优封闭液为0.5%BSA+0.05%Tween-20磷酸盐缓冲液,封闭时间为1 h,样品稀释液为1%BSA+0.05%Tween-20磷酸盐缓冲液,样品孵育时间为2 h,量子点偶联抗体孵育时间为1 h。灵敏性实验表明FLISA最低检测限度为1:1600稀释度,而传统双抗夹心ELISA为1:400稀释度。以梯度稀释的样品进行检测,构建了用于定量检测的标准曲线y=0.6176x+7559.5,R2为0.9719。特异性实验表明,该方法不会与犬瘟热病毒,犬细小病毒以及293T细胞和BSR细胞产生非特异性反应。本研究成功获得3株特异性好的抗狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体,并以此为基础偶联量子点建立荧光免疫吸附法用于检测狂犬病病毒G蛋白的含量,为今后狂犬病疫苗的效价评估提供一种快速、灵敏的检测方法。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 英文缩略词表（Abbreviation）
  • 1 文献综述
  •   1.1 狂犬病流行病学
  •     1.1.1 传染源
  •     1.1.2 传播途径
  •     1.1.3 易感动物
  •     1.1.4 发病机制
  •     1.1.5 疾病的防控
  •   1.2 狂犬病病毒分子生物学
  •   1.3 狂犬病诊断
  •     1.3.1 病史和临床症状
  •     1.3.2 病毒及其抗原检测
  •     1.3.3 狂犬病抗体检测
  •     1.3.4 病毒核酸检测
  •   1.4 量子点
  •     1.4.1 量子点抗体偶联技术
  •     1.4.2 量子点的生物学应用
  • 2 研究目的与意义
  • 3 实验材料与方法
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 细胞、病毒与商业化疫苗
  •     3.1.2 实验动物
  •     3.1.3 主要仪器及设备
  •     3.1.4 主要试剂
  •     3.1.5 主要试剂的配方
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 免疫原的制备
  •     3.2.2 免疫程序
  •     3.2.3 筛选方法的建立及免疫小鼠的血清抗体效价的测定
  •     3.2.4 饲养细胞的制备
  •     3.2.5 SP2/0骨髓瘤细胞的制备
  •     3.2.6 免疫脾细胞的制备
  •     3.2.7 细胞融合
  •     3.2.8 融合细胞的选择性培养和单克隆抗体筛选
  •     3.2.9 杂交瘤细胞的克隆化（有限稀释法）
  •     3.2.10 杂交瘤细胞的冻存与复苏
  •     3.2.11 单克隆抗体的大量制备及纯化
  •     3.2.12 单克隆抗体的特性鉴定
  •     3.2.13 量子点荧光探针的制备
  •     3.2.14 量子点标记单克隆抗体的鉴定
  •     3.2.15 量子点标记荧光免疫吸附法的建立和实验条件的摸索
  • 4 结果与分析
  •   4.1 狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体的制备
  •     4.1.1 免疫原
  •     4.1.2 狂犬病病毒最佳包被浓度的确定
  •     4.1.3 免疫小鼠血清抗体效价
  •     4.1.4 杂交瘤细胞株的筛选
  •     4.1.5 单克隆抗体的纯化
  •     4.1.6 单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定
  •     4.1.7 单克隆抗体的Western blot鉴定
  •     4.1.8 单克隆抗体的染色体分析
  •     4.1.9 单克隆抗体亚类鉴定
  •     4.1.10 单克隆抗体的效价
  •     4.1.11 单克隆抗体的抗原表位的鉴定
  •   4.2 量子点标记荧光免疫吸附法的建立
  •     4.2.1 ZnCdSe/ZnS量子点标记抗体前后表征
  •     4.2.2 方阵滴定法确定包被抗体与标记抗体的最佳比例
  •     4.2.3 封闭液的确定
  •     4.2.4 封闭时间的确定
  •     4.2.5 样品稀释液的确定
  •     4.2.6 样品最佳孵育时间的确定
  •     4.2.7 量子点偶联抗体孵育时间的摸索
  •     4.2.8 灵敏度摸索与定量标准曲线的建立
  •     4.2.9 特异性试验
  •     4.2.10 检测商业化兽用狂犬病疫苗
  • 5 讨论
  •   5.1 单克隆抗体免疫原的选择
  •   5.2 G蛋白单克隆抗体的特异性分析
  •   5.3 G蛋白单克隆抗体的抗原表位分析
  •   5.4 基于量子点的荧光免疫吸附法的优势
  • 6 结论
  • 参考文献
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 全晓杭

    导师: 赵凌

    关键词: 狂犬病蛋白,单克隆抗体,量子点,荧光免疫吸附法

    来源: 华中农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 华中农业大学

    分类号: S852.65

    DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000379

    总页数: 72

    文件大小: 3317K

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