肖开田[1]2004年在《水牛GV期卵母细胞程序化冷冻研究》文中进行了进一步梳理水牛繁殖存在许多问题，如性成熟较晚、发情不明显、发情后期长、受胎率低等。与黄牛相比，水牛胚胎生物技术相关研究较为滞后，文献报道也相对较少。有关水牛胚胎的程序化冷冻有过成功的报道并产犊，但未见程序化冷冻水牛卵母细胞的报道。本实验旨在探索水牛生发泡(GV)期卵母细胞程序化冷冻保存的条件，希望能提高其保护效果，为水牛的IVM、IVF、核移植等生物技术提供实验材料。 本实验采用程序化冷冻方法，对不同植冰温度(-5.5℃、-6℃、-6.5℃、-7℃)下几种冷冻液[PBSm(PBS+FBS)、PEGF(PBSm+EG+GL)、PEF(PBSm+EG)、PGF(PBSm+GL)]的结晶变化进行了探讨，进而探讨了不同植冰温度(-6℃、-6.5℃、-7℃)、不同冷冻保护液[PBSm(对照)、PEGF、PEF、PGF]对水牛GV期卵母细胞的冷冻保护效果。 1．实验过程中我们将水牛卵巢采卵情况与一同采回的黄牛卵巢采卵情况作了比较：从单个水牛卵巢回收的卵母细胞数平均为4.85个，从单个黄牛卵巢回收的卵母细胞数平均为13.4个，平均每个卵巢回收卵母细胞数水牛明显低于黄牛，外观形态正常、可用的卵母细胞比率也极显着低于黄牛(水牛66.3％，黄牛87.9％，P＜0.01)。 2．在-5.5℃、-6℃、-6.5℃、-7℃四种温度下植冰，以植冰后平衡10min结晶为适宜的保护指标，用PBSm作对照，观察PEGF、PEF、PGF在植冰后不同时问(2，5，8，10，15min)的结晶情况。结果显示：PBSm在四种植冰温度植冰后都很快完全结晶(2min)；植冰温度为-5.5℃时，植冰后10min PEGF、PEF、PGF未完全结晶，15min时PGF仍未完全结晶；植冰温度为-6℃，植冰后10min PEGF、PEF、PGF完全结晶；植冰温度为-6.5℃，植冰后8min PEGF、PEF、PGF完全结晶；植冰温度为-7℃，植冰后5min PEGF、PEF、PGF完全结晶。说明保护液中单独添加GL比单独添加EG有较低结晶速率，PEGF和PEF的结晶效果明显好于PGF和PBSm。在四种植冰温度下表现出温度越低结晶效果越好的趋势。 3．-6℃、-6.5℃、-7℃叁种植冰温度下植冰，程序化冷冻解冻水牛GV期卵母细胞的形态正常率为：PEGF(84％、88.37％、90.9％)＞PEF(73.7％、78％、76.7％)＞PGF(58％、59％、57.5％)＞PBSm(50.7％、47.2％、47.4％)。同种植冰下，PEGF与PGF间差异显着(p＜0.05)，PEF与PBSm间差异显着(p＜0.05)，PEGF与PBSm间差异极显着(p＜0.01)。同种冷冻保护液，-6℃、-6.5℃、-7℃植冰，效果差异不显着。 4．-6℃、-6.5℃、-7℃植冰，程序化冷冻解冻后水牛GV期卵母细胞成活率(0.8％台盼兰染色判断)为：PEGF(76.9％、87.5％、83.3％)＞PEF(64.0％、70.8％、66.7％)＞PGF(47.4％、55.0％、55.6％)＞PBSm(16.7％、37.5％、35.3％)。植冰温度为-6℃时的成活率低于-6.5℃和-7℃的成活率。同种植冰温度下，PEGF与PEF间、PEF与PGF间、PGF与PBSm间染色成活率差异不显着，但PEGF与PGF间、PEF与PBSm间差异极显着(P＜0.01)，说明在-6.5℃或-7℃植冰温度下使用PEGF冷冻保护液比较好。西南农业大学硕士学位论文中文摘要旦旦口组且口里口级旦口.口口.. 5一6℃、芍.5℃、一℃叁种植冰温度植冰，程序化冷冻解冻后水牛GV期卵母细胞成熟率为:PEGF(1 8.9%、20.5%、20.0%户PEF(9.7%、18.2%、15.6%卜PGF(6.9%、7.7%、8.3%卜PBSm(0、0、0).峨5℃植冰，PEGF作冷冻保护液有2枚卵母细胞发生卵裂，PEF作冷冻保护液有1枚卵母细胞发生卵裂;一℃植冰，PEGF作冷冻保护液有1枚卵母细胞发生卵裂.说明EG和GL混合使用，保护效果好于EG或GL单独使用，据此得出，在双5℃或一7℃植冰，用PEGF作冷冻保护液保存水牛GV期卵母细胞效果比较好。 6.通过将冷冻处理与未冷冻处理的水牛GV期卵母细胞的IVM效果比较，差异极显着 (P<0川)，说明冷冻对水牛GV期卵母细胞的损伤严重. 结果表明:用PEGF作冷冻保护液，装管前用2步法平衡，植冰温度用戒5℃或一℃，植冰后平衡l伽min，以0.3℃lmin降至一5℃投入液氮，解冻采用快速解冻、2步脱出保护剂，对水牛CV期卵母细胞冷冻效果好。
史蕾[2]2013年在《牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻技术优化及其作用机制研究》文中提出牛GV期卵母细胞相对于成熟卵母细胞的冷冻保存要困难很多,但在远距离运输卵母细胞时,必须进行冷冻保存。因此,开发GV期卵母细胞冷冻保存技术对于充分利用未成熟卵母细胞、特别是远距离屠宰场卵巢卵母细胞保存具有重要的现实意义。海藻糖(trehalose)是一种类似于蔗糖的非还原性双糖,能形成玻璃状保护层保护处于极端条件下的生命体,因此探索海藻糖作为非渗透性冷冻保护剂替代常规玻璃化冷冻保护剂(CPA)中蔗糖、用于冷冻保存GV期卵母细胞的可能性,并找到最适替代浓度是本研究的目的之一。有研究证明,常规溶解冷冻保护剂的缓冲介质DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)中的主要成分NaCl,对胚胎的超低温冷冻具有一定的危害,但其对卵母细胞尤其是GV期卵母细胞的保护作用未见报道。因此,本研究的目的之二,是以氯化胆碱代替NaCl,以及联合海藻糖和氯化胆碱用于GV期卵母细胞的冷冻保存,探索其保护效果。此外,本研究的目的之叁,是研究冷冻损伤的机制,凋亡基因和周期基因相对表达量的差异性。研究内容和结果如下：1.不同浓度海藻糖对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻的效果(1)在对不同浓度海藻糖作为非渗透性保护剂对卵母细胞存活能力评价的实验中,发现冷冻组中0.5M海藻糖组活力强的比率不如0.5M蔗糖组(39.8%vs52.5%,p<0.05),但是0.5M海藻糖组的总的存活的卵母细胞比率比0.5M蔗糖组高(70.1%vs63.6%,p<0.05),其他冷冻组之间无显着差异。(2)在CPA中添加不同浓度海藻糖后透明带硬度测定实验中,0.5M蔗糖组中透明带溶解时间(93±2.5min)显着少于其他冷冻组,0.5M海藻糖组(95.5±2.6min)、0.3M海藻糖组(93.3±3.8min)除外(p<0.05)。(3)卵母细胞发育能力与对照组相比,冷冻显着降低了胚胎的卵裂率和囊胚率(p<0.05),1M海藻糖组、0.8M海藻糖组、0.1M海藻糖组冷冻保存的卵母细胞不能发育到囊胚期,0.5M蔗糖组与0.5M海藻糖组、0.3M海藻糖组胚胎的卵裂率和囊胚率差异不显着(p>0.05),且0.5M蔗糖组(13.9±2.3%)和0.5M海藻糖组(12.2±0.9%)、0.3M海藻糖组(10.4±2.8%)的胚胎卵裂率显着高于其它组(0.8M海藻糖组(7.7±4.3%)除外)(p<0.05)；0.5M蔗糖组(2.5±2.2%)和T3(1.5±1.3%)、0.3M海藻糖组(1.3±2.2%)的囊胚率要高于其它组,但差异不显着。(4)检测体外培养成熟的卵母细胞的纺锤体形态,实验结果发现,冷冻保护剂中浓度相同(0.5mol/L)两种糖具有类似保护效果,冷冻液中添加不同浓度的海藻糖会起到不同程度的保护作用。实验结论：海藻糖可以作为蔗糖的替代物用于GV期卵母细胞玻璃化冷冻,O.3mol/L-0.8mol/L均能达到一定的保护作用,但0.5mol/L为最适宜替代浓度。2.牛GV期卵母细胞冷冻损伤的分子机制(1)通过细胞凋亡检测试剂盒免疫荧光染色法检测卵母细胞凋亡,实验结果表明：0.5M蔗糖组(4.1±0.9%)、0.5M海藻糖组(5.5±2.6%)卵母细胞未凋亡的比率显着低于(p<0.05)新鲜卵组(13.o±0.9%)；(2)通过检测细胞凋亡相关基因BAX inhibitor和BAX,以及细胞周期相关基因CDC2和CyclinBI的mRNA相对表达量,发现经过冻融的卵母细胞,其mRNA表达水平明显受到影响,凋亡基因BAX和周期相关基因CDC2表达水平上调,另两个表达水平总体下调。实验结论：冷冻引起GV期卵母细胞凋亡加剧,冷冻损伤主要是通过引起凋亡的途径进行的。3.改良磷酸盐缓冲液(mPBS)配制玻璃化冷冻液卵母细胞冷冻效果评价1)CPA中氯化钠以氯化胆碱替代后,卵母细胞成活率0.5M蔗糖组(24.2%)显着低于对照组(90.4%)、mPBS+0.5M蔗糖组(42.2%)和mPBS+0.5M海藻糖组(47.0%)(p<0.05)。mPBS+0.5M蔗糖组和mPBS+0.5M海藻糖组在统计学上差异不显着,但后者高于前者(p>0.05)。2)CPA中氯化钠以氯化胆碱替代后,透明带溶解时间冷冻组0.5M蔗糖组(103±4.16mmin)显着长于mPBS+0.5M海藻糖组(86.67±5.69min)和mPBS+0.5M蔗糖组(89.00±9.54min)(p<0.05)。3)CPA中氯化钠以氯化胆碱替代后,卵母细胞成熟培养后体外受精,受精胚胎的卵裂率,冷冻组显着低于对照组(45.4±0.9%,p<0.05),mPBS+0.5M蔗糖组(28.4±0.5%)和mPBS+0.5M海藻糖组(26.8±2.1%)显着高于0.5M蔗糖组(14.2±2.6%)(p<0.05)；囊胚率0.5M蔗糖组(2.3±2.0%)、mPBS+0.5M蔗糖组(3.2±0.1%)低于mPBS+0.5M海藻糖组(3.9±0.9%),叁组在统计学上差异不显着(p>0.05)。实验结论：DPBS中的钠离子对牛GV期卵母细胞冷冻有一定的危害,以氯化胆碱替代,能起到一定的保护作用,并且非渗透性保护剂0.5mol/L海藻糖替代蔗糖,与氯化胆碱配合使用,能达到更优效果。
陈玉[3]2008年在《水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究》文中进行了进一步梳理本试验主要探索了水牛MⅡ期卵母细胞及GV期卵母细胞的玻璃化冷冻保存方法。探讨水牛MⅡ期卵母细胞冷冻保存的方法,通过对3种抗冻保护剂组合(Ⅰ:20%乙二醇+20%二甲基亚砜;Ⅱ:20%乙二醇+20%1,2-丙二醇;Ⅲ:20%乙二醇+20%1,2-丙二醇+10%二甲基亚砜)的毒性试验,发现实验组的形态正常率均低于对照组(未处理组)(P＜0.05);Ⅰ组的孤雌激活效果与对照组没有显着差异(P＞0.05);Ⅱ组体外受精后分裂率明显低于对照组(P＜0.05),但8-细胞率和囊胚率与对照组没有显着差异(P＞0.05)。在此基础上,以抗冻保护剂Ⅰ组做冷冻液,探讨了解冻液中蔗糖梯度浓度(A:0.5M-0.25M-0.10M与B:0.62M-0.42M-0.31M)对解冻效果的影响。A、B两组的形态正常率和孤雌激活后续发育能力均比对照组低(P＜0.05),其中B组的分裂率和囊胚率相似于对照组。其次,比较了3种抗冻剂组合的冷冻效果。解冻后实验组的形态正常率和孤雌激活后的发育能力均低于对照组(P＜0.05),但Ⅰ组的囊胚率对照组和其他两个实验组没有显着差异(P＞0.05)。经体外受精后的发育能力也低于对照组,且Ⅰ组分裂率明显低于Ⅱ组(P＜0.05)。选出最佳抗冻剂组合后,探讨了GMP、CLV和半麦管法的冷冻效果。冻后卵母细胞的形态正常率及分裂率、8-cell率均低于对照组(P＜0.05),而实验组间没有显着差异。GMP法囊胚率与对照组相似(P＞0.05),而其他两种方法显着较低(P＜0.05)。此外,还探讨了冷冻液和解冻液中分别添加蔗糖或海藻糖对冷冻效果的影响。解冻后,实验组的形态正常率及孤雌激活后8-细胞之后的发育能力均低于对照组(P＜0.05),但实验组间无显着差异(P＞0.05)。其中,添加蔗糖组的分裂率显着低于对照组。利用优化后的卵母细胞冷冻液和冷冻方法,探讨了水牛GV期卵母细胞的冷冻效果。结果表明,GV期冻后卵母细胞的形态正常率,及孤雌激活的后续发育潜力均明显低于未冷冻组(P＜0.05)。而在进一步探讨不同发育阶段的水牛卵母细胞冷冻保存效果中发现,GV期卵母细胞的形态正常率,体外成熟后的孤雌激活分裂率和8-细胞率显着低于MⅡ期(P＜0.05)。以上结果表明:1.叁种冷冻玻璃化液均可用于冷冻水牛MⅡ期卵母细胞;2.水牛MⅡ期卵母细胞解冻时采用浓度梯度依次为0.62M、0.42M和0.31M的海藻糖解冻液去除防冻剂可取得较好的冷冻保存效果;3.玻璃微细管法、铜环法和半麦管法均可用于水牛MⅡ期卵母细胞的保存,其中玻璃微细管法冷冻效果最好;4.水牛GV期卵母细胞冷冻的效果比MⅡ期差。
赛务加甫[4]2007年在《提高绵羊体细胞核移植效率的研究》文中研究说明本研究对绵羊卵母细胞体外成熟、卵母细胞冷冻保存、卵母细胞孤雌激活、绵羊同种和异种体细胞核移植及重构胚胎体外培养等关键技术进行了试验分析,以期提高绵羊体细胞核移植的效率,建立完善的核移植技术体系,为进一步获得体细胞克隆绵羊和异种克隆个体提供技术支撑。本研究内容包括以下几个方面:(1)在绵羊卵母细胞成熟培养液中添加孕酮等某些影响体外成熟的成份,确定绵羊卵母细胞的最佳成熟方案。(2)并通过对比不同冷冻保护剂对卵母细胞的冷冻保存效果,为核移植操作批量提供成熟的卵母细胞。(3)采用胞质注射法,建立精子提取物激活卵母细胞的方法,并且与离子霉素结合6-DMAP激活法和电激活法进行了比较,筛选出适宜激活方法。(4)体外分离培养得到道赛特绵羊和莎能奶山羊的耳皮肤成纤维样细胞,对绵羊皮肤成纤维细胞的生物学特性和不同细胞因子对其生长增殖的影响进行了研究,并对绵羊成纤维细胞和山羊成纤维细胞分别进行体外传代及冻存,为绵羊体细胞核移植和绵羊-山羊种间核移植试验提供了供体细胞。(5)绵羊孤雌激活胚、绵羊重构胚和绵羊-山羊种间重构胚分别置于不同的培养系统中培养,优化绵羊胚胎体外体系,增加胚胎的体外发育潜力。主要研究结果如下:1.绵羊卵母细胞体外成熟基础液中分别添加5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%发情牛血清(OCS)、5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%胎牛血清(FBS)、0.075 IU/mL HMG+OCS和0.075 IU/mL HMG+10% FBS,结果表明成熟液中添加OCS更有利于卵母细胞的成熟;添加5%～10%的BFF能够提高卵母细胞的成熟率,但20%BFF卵母细胞的体外成熟率下降;培养液中分别添加0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL和2.0μg/mL孕酮,结果表明孕酮的最适添加剂量为0.5μg/mL。结果表明绵羊卵母细胞的体外成熟培养液组成为M199+10 mmol/L Hepes+0.38 mmol/L丙酮酸钠+ 25 mmol/L谷氨酰胺+1μg/mL 17β雌二醇(17β-E2)+5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%OCS+0.5μg/mL孕酮时其体外成熟培养效果最好。2.采用程序冷冻法对处于不同发育时期的绵羊卵母细胞进行冷冻保存,冷冻液Ⅰ～冷冻液Ⅳ对同一时期卵母细胞冷冻解冻后的形态正常率、卵裂率和桑囊胚发育率均无显着影响,而冷冻液Ⅳ体外成熟24 h冷冻解冻后的卵母细胞发育率显着高于GV期和体外成熟10 h的卵母细胞,说明用乙二醇(EG)作为冷冻保护剂,添加0.1 mol/L海藻糖较合适对成熟培养24 h的绵羊卵母细胞进行冷冻保存;-6.5℃植冰时冷冻卵母细胞囊胚发育率显着高于其他组。采用玻璃化冷冻方法对绵羊GV期到体外成熟培养24 h卵母细胞进行冷冻保存试验证实,以玻璃化冷冻液Ⅱ作为冷冻剂,体外成熟培养24 h卵母细胞的卵裂率和囊胚发育率最好,不经过成熟培养的卵母细胞玻璃化冷冻效果最差,认为添加0.1 mol/ L海藻糖来进行卵母细胞的玻璃化冷冻可以起到保护作用,卵母细胞冷冻解冻后可以用作受体胞质进行核移植,重构胚的发育能力受冷冻处理的影响不显着。3.对绵羊卵母细胞以连续3次120 v/mm的直流脉冲进行电激活获得最佳激活效果,囊胚发育率显着高于脉冲1次和2次(P<0.05);用分别注射不同剂量的精子提取物,对绵羊卵母细胞进行孤雌激活,结果表明最佳注射剂量为向每个卵母细胞注入精子提取物3 pL;分别用电激活法,离子霉素联合6-DMAP法和精子提取物胞质内注射法对绵羊卵母细胞进行激活,结果表明电脉冲的激活效果显着低于后二者的效果,且差异显着,精子提取物和离子霉素联合6-DMAP法的囊胚率差异不显着,均可以用于绵羊卵母细胞的激活。4.高糖DMEM较适宜于绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养和继代培养。以DMEM+50% NCS(new - born calf serum),添加10% DMSO为冻存保护剂,进行冷冻保存的无角道赛特绵羊皮肤成纤维细胞,解冻细胞经体外5~6次传代培养,细胞形态维持在初始状况,保持了良好的遗传特性;添加EGF和胰岛素对绵羊皮肤成纤维细胞的生长均有促生长作用。5.卵母细胞体外成熟培养时间分别为15~17 h、19~21 h与23~25 h时,随着培养时间的增加成熟率也增加,卵母细胞去核成功率随着成熟时间的延长而下降,试验认为卵母细胞体外成熟19~21 h,既可以保证高的去核成功率,又可以保证卵母细胞较高的成功率,有利于提供充足的卵源;不经血清饥饿处理的供体细胞采用胞质注射法构建克隆胚,其胚胎发育率略高于血清饥饿处理组,但差异不显着。试验认为体外成熟培养19~21 h的卵母细胞可以作为核移植受体细胞,未经血清饥饿处理的成纤维细胞作为供体细胞进行核移植,可以获得较高的重构胚胎发育率。6.采用胞质内注射法构建绵羊皮肤纤维细胞重组胚,胚胎经离子霉素联合6-DMAP激活后,其细胞融合率、卵裂率和囊胚发育率均高于电融合法,同时结果表明重构胚用离子霉素联合6-DMAP或精子提取物激活后,卵裂率和囊胚发育率相近,其中精子提取物的激活效果优于离子霉素激活法;激活间隔时间研究结果证实,卵母细胞注核后经体外培养3～4 h后再激活,可以获得较高的激活率。7.用冷冻的山羊成纤维细胞可以成功构建山羊-绵羊异种体细胞核移植胚,种间体细胞核移植胚能够进行正常的早期发育,种间重构胚经离子霉素联合6-DMAP或者胞质注射精子提取物激活后,卵裂率和囊胚发育率差异不显着(P>0.05);用电脉冲融合法构建异种核移植胚胎时,其融合率、卵裂率和囊胚发育率均低于胞质注射法;不同山羊供体细胞进行山羊-绵羊异种核移植胚胎构建时,血清饥饿处理与否对种间核移植囊胚率无显着影响,表明山羊皮肤成纤维细胞可以不经过血清饥饿处理直接进行核移植。8.联合使用培养液能改善绵羊同种和异种重构胚的发育。即使用CR1aa+BSA培养重构胚3 d,再用SOFaa+5%FBS继续培养,获得的重构胚囊胚发育率较高。在胚胎培养液中添加孕酮可在一定程度上提高重构胚的卵裂率和囊胚率。其中以2.0和4.0μg/mL孕酮组的囊胚率最高,与对照组和其他孕酮浓度组差异显着。发现共培养体系对绵羊同种核移植重构胚的发育有显着的影响,而且在3 d更换1次新的饲养细胞单层对重构胚的发育有明显的促进作用。
郭娟[5]2009年在《牛卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究》文中研究说明本论文主要探索了牛第二次减数分裂中期(MII期)卵母细胞和生发泡期(GV期)卵母细胞的玻璃化冷冻保存方法,研究结果如下:分别用玻璃微细管(GMP)法和固体表面玻璃化(SSV)法冷冻保存牛MII期卵母细胞,结果表明,SSV法(32.6%)略优于GMP法(27.1%),但经统计分析显示,GMP法(27.1%)与SSV法(32.6%)的卵裂率差异不显着(P＞0.05),两种冷冻方法与未经冷冻保存的对照组(57.9%)存在极显着差异(P＜0.01)。分别用体外受精和孤雌激活法对牛MII期卵母细胞和冷冻解冻后的卵母细胞进行体外培养,结果表明,SSV+孤雌激活组(2.7%)略优于SSV+体外受精组(0.6%),但经统计分析显示,SSV+体外受精组(0.6%)和SSV+孤雌激活组(2.7%)对冷冻后卵母细胞发育为囊胚的比率差异不显着(P＞0.05),但冷冻组与未经冷冻保存的对照组显着极差异(0.6%,2.7%和23.2%,22.7%,P＜0.01)。不同浓度细胞松弛素B(CB)预处理对牛体外成熟卵母细胞玻璃化冷冻后发育能力的影响,结果表明:存活率上,各浓度CB处理组与对照组没有显着差异(P＞0.05);激活后卵裂率上,20μg/ml CB处理组显着高于对照组(47.67%和30.25%,P＜0.05);囊胚率上,20μg/ml CB处理组极显着高于对照组(9.00%和1.75%,p≤0.01),同时还显着高于其它4个处理组(P＜0.05)。说明CB在玻璃化冷冻过程中的保护作用存在一定浓度的依赖性,其中用浓度20μg/ml CB处理最适于牛成熟卵母细胞玻璃化冷冻效果的改善。不同浓度细胞松弛素B预处理牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻的影响,结果表明:玻璃化冷冻后,CB处理组和未处理组之间卵母细胞成熟率差异不显着(P＞0.05),但均显着低于体外培养组。说明试验中所用浓度CB(2.5、7.5、15、20和30μg/ml)对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果的改善作用不明显。
唐业刚[6]2006年在《水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存的研究》文中研究指明随着动物胚胎工程技术的飞速发展，能否挖掘卵巢卵母细胞的潜力，获取更多质量优等的卵母细胞数量越来越成为制约体外受精、核移植、胚胎移植等后续研究发展的问题，卵母细胞冷冻保存的研究则可有效解除上述技术因卵母细胞来源问题受到的时间和空间限制。本研究以水牛卵母细胞为材料，在深入理解快速冷冻保存原理和水牛卵母细胞的结构特点与生长发育规律的基础上，从制约水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存的关键因素入手，结合实验室现有条件，探讨了冷冻载体、冷冻保护剂DMSO及血清、卵丘颗粒细胞、卵母细胞不同成熟阶段和解冻方法对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响，旨在探索科学有效冷冻水牛卵母细胞的方法，并为解决实验室因水牛卵巢来源有限使其它后续研究受到严重制约的问题提供一些有益的参考。现将研究结果简述如下： 1 冷冻载体对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响。以体外成熟培养18h的牛卵母细胞为材料，以A(0.25ml塑料细管)、B(玻璃细管1)、C(玻璃细管2)、D(截取的拣卵针尖端部分)四种细管作为冷冻载体，采用先在10％DMSO+20％FBS的VS_1中预处理30s，再在20％DMSO+20％FBS的VS_2中处理约30s，冷冻卵母细胞，二步法解冻后补足卵母细胞剩余培养时间并行孤雌激活，统计卵母细胞回收率、形态正常率、成熟率、2—8细胞卵裂率。对照组不经冷冻直接行体外成熟、孤雌激活。研究发现：对照组成熟率、2-4，8细胞卵裂率(68.3％、51.7％、36.1％)均显着高于其它组，表明冷冻对水牛卵母细胞的发育造成很大的损伤。A组卵母细胞解冻后形态正常率、成熟率、2—4细胞，8-细胞卵裂率分别为87.2％、43.9％、34.1％、21.9％，显着低于B(93.8％、51.7％、40.0％、28.3％)、C(94.7％、51.9％、40.7％、27.8％)、D(94.4％、55.9％、41.2％、29.4％)叁组，表明A组不适合作为冷冻载体。D组虽然卵母细胞解冻后体外成熟、2—4，8-细胞卵裂率很高，但其卵母细胞解冻后的回收率(69.2％)却显着低于A(87.0％)、B(94.1％)、C(91.9％)组，过低的回收率也使之不适宜作为冷冻载体。B、C组则在卵母细胞解冻后回收率(94.1％ Vs 91.9％)、形态正常率(93.8％ Vs 94.7％)、成熟率(51.7％ Vs 51.9％)、2-4(40.0％ Vs 40.7％)，8-细胞(28.3％ Vs 27.8％)卵裂率各项数据上居于A、D之间，且B、C之间无显着差异。综上，B、C两种玻璃细管适合作为水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存的冷冻载体。实验2—6均采
周悦[7]2014年在《玻璃化冷冻保存对猪卵母细胞影响的初步研究》文中认为为了探索对于猪不同时期卵母细胞毒性最低,冷冻效果最佳的冷冻保护液配方,寻找最适合猪不同时期卵母细胞的冷冻方法,分析猪不同时期卵母细胞冻后发育能力降低的影响因素,从而为成功冷冻猪卵母细胞能应用于生产实际提供理论支持。因此本研究以GV期和MⅡ期卵母细胞作为试验材料,应用玻璃化冷冻方法,就目前应用最多的七种冷冻保护液配方进行筛选,比较叁种不同冷冻载体冷冻卵母细胞的效果差异,并通过透射电镜方法观察卵母细胞冷冻前后的超微结构变化,采用彗星电泳方法分析冷冻对卵母细胞造成的DNA损伤情况。结果发现：1.七组冷冻保护液对MⅡ期卵母细胞有低毒性作用,各组分裂率、囊胚率、囊胚细胞数均低于对照组,5组的分裂率与对照组差异显着(P<0.05),1组的囊胚率与对照组差异显着(P<0.05)。其余各组间分裂率和囊胚率无统计学差异。综合各组指标选取3组、6组和7组为对猪MⅡ期卵母细胞的发育能力损伤最小的前叁组冷冻保护液,应用GMP管对其冷冻保护效果进行比较,发现乙二醇单独使用或者乙二醇和二甲基亚砜混合使用都是适合MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻的保护剂配方。综合考虑,选取HM+7.5%(DMSO+EG),HM+17％(DMSO+EG)+0.4M Su作为冷冻保护液来比较叁种不同冷冻载体冷冻卵母细胞的效果差异,发现OPS法形态正常率显着高于GMP法和半麦管法(P<0.05),分裂率显着低于半麦管法(P<0.05),叁种方法囊胚率差异不显着,但半麦管法获得5枚囊胚且囊胚细胞数量最高,OPS法获得1枚囊胚,而GMP法并未获得囊胚。且半麦管冻融后MⅡ期卵母细胞的分裂率高达53.67%,显着高于OPS法的29.33%及GMP法的35.00%。因此半麦管法更适合MⅡ期猪卵母细胞的玻璃化冷冻。2.应用七种不同冷冻保护液处理GV期卵母细胞发现,各组卵母细胞极体率与对照组差异不显着,说明冷冻保护液对GV期卵母细胞的成熟影响较低。对成熟后卵母细胞孤雌激活发现,1、7组的分裂率、囊胚率和囊胚细胞数与对照组均差异显着(P<0.05),其他各组间差异不显着。综合各项指标选取3组、5组、6组为对GV期卵母细胞处理损伤小的前叁组冷冻保护液,应用GMP法冷冻GV期卵母细胞发现,2组获得6枚囊胚,且第2组囊胚平均细胞数高于第1、3组。综合考虑,选取第2组HM+7.5%(DMSO+EG)、HM+15%(DMSO+EG)+0.5M Su作为冷冻保护液来比较叁种不同冷冻载体冷冻卵母细胞的效果差异,发现半麦管法冷冻GV期卵母细胞存活率显着高于OPS法和GMP法(P<0.05),但叁种方法获得的极体率、分裂率和囊胚率差异均不显着。因此半麦管法更适合GV期猪卵母细胞的玻璃化冷冻。3.透射电镜下观察卵母细胞发现,GV期卵母细胞与透明带连接紧密,微绒毛伸入透明带中,皮质区分布大量的线粒体。皮质区可见大量成簇的长管状内质网,散在的高尔基体。细胞质内可见许多脂肪滴,脂滴(LD)分为两种,一种为灰色脂滴(GLD),一种为深色脂滴(DLD),通常与线粒体相伴出现,且脂肪滴的周围由内质网不连续包裹着。MⅡ期卵母细胞排出第一极体,质膜下分布大量的皮质颗粒。微绒毛(Mv)缩短成矮柱状,线粒体(Mi)常聚集存在,线粒体嵴清晰,卵周隙出现。细胞质包含灰色脂滴和深色脂滴两种,无高尔基体。4.冻后GV期卵母细胞透明带、细胞膜损伤,微绒毛(Mv)消失,线粒体肿胀、嵴不明显。皮质区以深色脂滴为主,包围脂滴的内质网(ER)不完整,胞质内溶解为絮状,未见高尔基体。冻后MⅡ期卵母细胞透明带(ZP)损伤、微绒毛、细胞膜损伤甚至消失、极少量皮质颗粒分布于皮质区。脂滴部分溶解,相互连接,脂滴周围伴随大量肿胀呈圆形的线粒体,嵴不明显。玻璃化冷冻会造成GV期、MⅡ期卵母细胞不同程度的严重损伤。5.采用彗星电泳方法检测冷冻对卵母细胞DNA的损伤发现,冷冻保护液对GV期、MⅡ期卵母细胞的毒性较低,DNA损伤与对照组差异不显着,但玻璃化冷冻对GV期、MⅡ期卵母细胞的DNA损伤与对照组和冷冻保护液处理组相比差异显着(P<0.05)。玻璃化冷冻会对不同时期卵母细胞的DNA造成严重损伤。
杨素芳, 陈玉, 胡晓静, 冯贵雪, 潘红平[8]2008年在《玻璃化冷冻水牛MII期卵母细胞的初步研究》文中认为为建立玻璃化冷冻保存水牛MⅡ期卵母细胞的有效程序,试验比较了3种冷冻保护剂组合(Ⅰ:20%乙二醇+20%二甲基亚砜;Ⅱ:25%乙二醇+25%二甲基亚砜;III:25%乙二醇+25%甘油)和3种玻璃化冷冻方法(毛细玻璃管法、铜环法及半麦管法)对水牛MⅡ期卵母细胞的毒性和冷冻效果的影响。结果表明,Ⅲ组的卵母细胞形态正常率显着低于Ⅰ和Ⅱ组(P<0.05),且III组的存活率也显着低于Ⅰ组(P<0.05),而Ⅰ和Ⅱ组的卵母细胞形态正常率和存活率没有显着差异(P>0.05)。进一步孤雌激活发现,Ⅰ组的卵裂率显着高于Ⅲ组(29.17±4.81%,5.56±11.11%,P<0.05),Ⅰ组的囊胚发育率显着高于Ⅱ和Ⅲ组(8.33±2.23%,2.43±2.87%,1.86±3.71%,P<0.05),然而Ⅱ和Ⅲ组间的卵裂率和囊胚发育率没有差别(P>0.05)。采用铜环法的回收率显着高于半麦管法(P<0.05),但和毛细玻璃管法之间差异不显着(P>0.05),冻后卵母细胞孤雌激活后的卵裂率和囊胚发育率差异不显着(P>0.05)。3种冷冻保护剂中Ⅰ组的细胞毒性作用最小,Ⅲ组的细胞毒性作用最大;铜环法和毛细玻璃管法能有效冷冻保存水牛的MⅡ期卵母细胞。
黄雅琼[9]2008年在《猪体细胞核移植相关技术研究》文中提出1.探讨了猪卵母细胞体外成熟过程中减数分裂进程和卵母细胞的发育潜力。(1)不同直径卵泡内的卵母细胞的成熟进程及各时相出现的时间存在差异。直径＞2mm的卵泡内的卵母细胞体外培养16 h,大部分发生GVBD(germinal vesicle breakdown);卵母细胞GV期的比率由0h的68.00%下降到16h的15.38%;成熟培养20h时,终变期(diakinesis,DK)的比率达到峰值(27.06%),而MⅠ的峰值(69.69%)出现在培养后28h;成熟培养32～44h时,Ana-Ⅰ/Tel-Ⅰ期的比率达到最高(53.33%);成熟培养48h时,MⅡ期的比率达到最大值(63.64%)。(2)不同直径卵泡的卵母细胞体外成熟后的孤雌发育能力不同。直径＜2mm、直径2～6mm、直径＞6mm的卵泡的卵母细胞的成熟率分别为5.12%,66.63%和46.72%;分裂率分别为1.42%,72.19%和58.54%;囊胚率分别为0、28.76%和23.13%。直径＜2mm和＞6mm卵泡内的卵母细胞的卵裂率明显低于直径2～6mm卵泡的卵母细胞的卵裂率(P＜0.05)。直径2～6mm卵泡内的卵母细胞体外成熟较快,体外发育潜能较高。2.探讨了激素和生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果发现,在成熟液中添加0.1μg/mL FSH的卵母细胞成熟率显着高于添加0.01IU/mL人绝经期促性腺激素(hMG)的卵母细胞成熟率(P＜0.05),但两组间的分裂率和囊胚率差异不显着(P＞0.05)。猪卵母细胞分别在添加有0、10、30、50、70或90ng/mL表皮生长因子(EGF)的成熟液中成熟培养后进行孤雌激活,50ng/mL EGF组的成熟率达到66.89%,孤雌激活的分裂率达到84.90%,囊胚率达到30.20%,成熟率显着高于其余各组,分裂率和囊胚率高于对照组。在成熟液中添加10ng/mL胰岛素样生长因子(IGF-I)显着提高猪卵母细胞的第一极体排出率。在成熟液中同时添加50ng/mL EGF和10ng/mL IGF-I显着提高猪卵母细胞的孤雌发育能力(P＜0.05)。分别使用以TCM-199、NCSU-23(North Carolina State University-23,北卡大学胚胎培养液)和PZM-3为基础液的成熟液进行成熟培养猪卵母细胞,各组间在分裂率,成熟率和囊胚率方面差异不显着(P＞0.05),表明均可用于猪卵母细胞的体外成熟和体外培养。3.系统探讨了孤雌激活方法对猪卵母细胞孤雌发育效果的影响。结果发现:(1)浓度为9%的乙醇(EH)激活处理10min效果好于15min;(2)用9%EH激活处理10min后,再用2μmol/L 6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)培养处理3～4h的卵母细胞分裂率及囊胚率分别为82.86%和22.86%,显着高于再用10μg/mL放线菌酮(CHX)+10mmol/L SrCL_2(Sr~(2+))、10 mmol/L Sr~(2+)+2μmol/L 6-DMAP、10μ/mL CHX+2μmol/L6-DMAP或10μg/mL CHX+2μmol/L 6-DMAP+10 mmol/L Sr~(2+)培养处理3～4h的卵母细胞。(3)比较几种激活方法(5μmol/L Ion激活处理5min,9%乙醇激活处理10min,50 v/mm和50μs的电脉冲2次)的猪卵母细胞孤雌激活效果发现,离子霉素(Ion)的猪卵母细胞孤雌激活效果最好,囊胚率达到37.50%。(4)卵母细胞周围的卵丘细胞层数对其成熟后的孤雌发育有显着影响,4～6层和6层以上卵丘-卵母细胞复合体成熟后的孤雌激活分裂率(68.99%和75.36%)和囊胚率(32.56%和37.68%)显着高于其它组(p＜0.05)。4.对猪卵丘细胞、胎儿成纤维细胞和睾丸间质细胞的分离和传代培养进行了系统研究。结果发现,猪卵丘细胞单层的生长需要5～6d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10～11d和8～9d。酶消化法和钢网过滤筛选法可获得猪睾丸间质细胞,猪睾丸间质细胞单层生长需要3～5d。猪胎儿成纤维细胞冷冻解冻后,复苏率为68.36%。通过培养和观察,猪胎儿成纤维细胞的生长形成有规则的生长曲线。5.对猪体细胞核移植的方法及影响因素进行了探索。(1)猪卵母细胞体外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h后,分别进行去核构建重构胚,结果发现,成熟44h和48h的卵母细胞核移植后的融合率(58.99%和56.51%)、卵裂率(67.52%和65.73%)和囊胚率(22.78%和15.96%)较高,其中卵龄为44h的分裂率与囊胚率显着高于卵龄为40h、36h、32h、28h的卵母细胞(P＜0.05)。卵龄为48h的融合率高于卵龄为52h的卵母细胞(P＜0.05)。(2)盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view系统去核法的去核率分别为76.33%,100.00%,98.40%,前者低于后两者(P＜0.05);叁种去核方法去核的卵母细胞核移植后,分裂率以Hoechest染色法较低(P＜0.05),但融合率和囊胚率差异不显着(P＞0.05)。(3)不同注核方法(细胞质内注射法和透明带下注射法)的核移植效果研究结果显示,细胞质内注射和透明带下注射法的分裂率为(68.13%和60.37%)与囊胚率(6.44%和8.08%)差异均不显着(P＞0.05)。6.探讨了供体细胞种类及其培养处理方法对猪体细胞核移植效果的影响。(1)比较胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和卵丘细胞的核移植效果发现,胎儿成纤维细胞的融合率(64.74%)高于颗粒细胞(51.05%)和卵丘细胞(56.89%),但叁种细胞的卵裂率及囊胚率差异不显着(P＞0.05)。(2)不同代数的胎儿成纤维细胞的核移植效果的研究发现,6～9代的融合率显着高于3～5代和＞10代的成纤维细胞(P＞0.05),但卵裂率和囊胚率差异不显着(P＞0.05)。(3)不同性别猪胎儿成纤维细胞核移植效果的研究发现:雄性胎儿成纤维细胞核移植的融合率和分裂率与雌性胎儿成纤维细胞相比差异不显着(P＞0.05),但囊胚率显着低于雌性胎儿成纤维细胞(P＜0.05)。(4)100%长满汇合的胎儿成纤维细胞的核移植融合率高于70～80%汇合的胎儿成纤维细胞(P＜0.05),分裂率高于血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞(P＜0.05),但囊胚率差异不显着。(5)猪胎儿成纤维细胞冷冻解冻后的核移植分裂率和囊胚率均显着低于新鲜和4℃冷藏的细胞(P＜0.05),虽然融合率无显着差异(P＞0.05),表明猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植。(6)表面光滑的猪卵丘细胞做供体细胞的核移植后的分裂率和囊胚率均显着高于表面粗糙的猪卵丘细胞做供体细胞的核移植后的分裂率和囊胚率(P＜0.05),虽然融合率差异不显着(P＞0.05)。(7)直径＜15μm的供体细胞核移植后的融合率显着低于直径＞30μm的供体细胞(P＜0.05),直径20～3μm供体细胞核移植后的分裂率与囊胚率(63.73%和21.54%)较高。(8)组织块法和酶消化法分离得到的供体细胞所构建的重构胚在融合率、分裂率和囊胚率方面没有显着差异(P＞0.05)。
冯贵雪[10]2006年在《卵母细胞体外成熟及人胚胎玻璃化冷冻的研究》文中提出1．探讨了不同大小水牛卵泡卵母细胞体外成熟过程中的减数分裂进程及其胚胎发育潜能。结果发现，不同大小水牛卵泡卵母细胞成熟速度存在明显差异，卵泡的体积越大，卵母细胞的体外成熟速度越快；2～6mm卵泡卵母细胞体外成熟后具有较高的胚胎发育潜能。2．探讨了表皮生长因子(EGF)浓度(0，10ng／ml，25ng／ml，50ng／ml，100ng／ml)对水牛卵母细胞体外成熟的影响。EGF对水牛卵丘细胞的扩展没有影响，但不同浓度的EGF均显着提高水牛卵母细胞的第一极体(PB1)排出率和孤雌激活后的囊胚孵化率，其中以25ng／ml的EGF效果最好。3．探讨了MEM维生素的浓度(0，0.2％，0.5％，1％，1.5％)对水牛卵母细胞体外成熟的影响。添加0.2％和0.5％的MEM维生素对水牛卵丘细胞的扩展没有影响，但显着提高卵母细胞孤雌激活后的囊胚发育率、囊胚孵化率和囊胚细胞数；然而，当浓度升高到1.0％或1.5％时，明显抑制卵丘的扩展和降低PB1的排出率。4．研究了人绒毛膜促性腺激素(HCG)浓度(0.75 IU／ml，2.5 IU／ml，5 IU／ml，7.5IU／ml)对水牛卵母细胞体外成熟的影响。HCG显着促进水牛卵丘细胞的扩展和PB1的排出，但对水牛卵细胞孤雌激活后的胚胎及囊胚细胞数没有影响。5．探讨了水牛和人无卵丘卵母细胞体外成熟的可行性。结果发现，未扩展卵丘细胞包围法和扩展卵丘细胞团支撑法可促进卵丘细胞与卵母细胞间的间隙连接重建，进而促进无卵丘水牛卵母细胞的体外成熟；与单层卵丘细胞共培养并不能促进无卵丘水牛卵母细胞的体外成熟；卵巢组织包围培养不能模拟体内卵巢的环境，且卵巢组织可能分泌抑制卵母细胞胞质成熟的因子；扩展卵丘细胞团支撑法能明显促进人无卵丘卵母细胞减数分裂的恢复，其成熟培养的无卵丘人卵母细胞显微受精后能发育成为正常囊胚；卵泡液有利于人卵丘细胞团叁维结构的维持。6．探讨了玻璃化冷冻保存人4-8细胞胚胎的可行性及其临床应用价值。结果发现，胚胎承载器具和冷冻样品体积对人4-8细胞胚胎的玻璃化冷冻保存效果有显着影晌，冷冻样品的体积越小，其胚胎冷冻保存的效果越好，玻璃毛细管(GMP)的玻璃化冷冻保存效果优于拉细开口塑料细管，是一种可用于临床的人4-8细胞胚胎高效冷冻方法。7．探讨了胚胎培养结合玻璃化冷冻技术挽救人低评分胚胎的可行性。结果发现，第叁天(D3)早期低评分胚胎不宜进行冷冻保存，但经过体外培养后部分胚胎能够形成囊胚，且这些囊胚可以玻璃化冷冻保存，解冻移植后能够获得健康婴儿。
参考文献：
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[2]. 牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻技术优化及其作用机制研究[D]. 史蕾. 华中农业大学. 2013
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[4]. 提高绵羊体细胞核移植效率的研究[D]. 赛务加甫. 西北农林科技大学. 2007
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[7]. 玻璃化冷冻保存对猪卵母细胞影响的初步研究[D]. 周悦. 广西大学. 2014
[8]. 玻璃化冷冻水牛MII期卵母细胞的初步研究[J]. 杨素芳, 陈玉, 胡晓静, 冯贵雪, 潘红平. 湖北农业科学. 2008
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[10]. 卵母细胞体外成熟及人胚胎玻璃化冷冻的研究[D]. 冯贵雪. 广西大学. 2006