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本生烟草响应铅胁迫基因的克隆及功能初步分析

2020-12-02阅读(472)

本生烟草响应铅胁迫基因的克隆及功能初步分析

论文摘要

随着工业发展,全球铅（Lead,Pb）污染成为了不容忽视的环境问题之一。铅及其化合物会对大气、土壤、水体以及动植物造成污染。研究表明,植物在逆境胁迫下为了维持细胞正常代谢或降低逆境对自身的危害,会调节特定基因的表达水平,进而产生一系列复杂的表观遗传学变化,如基因组DNA甲基化修饰,来抵抗胁迫。目前尚不清楚植物在应答铅胁迫过程中,哪些基因DNA甲基化修饰发生变化,以及这些基因如何参与调控植物应答铅胁迫。本实验室前期利用DNA甲基化敏感扩增多态性技术（methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP）分析铅胁迫对本生烟草（Nicotiana benthamiana）基因组甲基化情况,克隆了多条与DNA甲基化调控相关的基因。本论文选定其中七条基因,分别为DNA-directed RNA polymerase subunit beta（NbDDRP）、EH domain-containing protein1（NbEF）、Homogentisate phytyltransferase（NbHPT）、NADH dehydrogenase（NbNADH）、Transmembrane protein（NbTM）、V-type proton ATPase subunit F（NbVAPF）、WRKY transcription factor（NbWRKY）,通过Real-time PCR（qRT-PCR）、重亚硫酸盐测序（Bisulfite Sequencing PCR,BSP）技术、病毒诱导的基因沉默（Virus-induced Gene Silencing,VIGS）技术和亚细胞定位技术,初步研究这些基因在植物响应重金属Pb2+胁迫过程中的功能。主要结论如下:（1）不同浓度Pb2+处理本生烟草15天后,分析本生烟草的甲基化酶（CMT3、MET1、DRM2）和去甲基化酶ROS1的表达量、候选基因表达量的变化情况,可知Pb2+胁迫能够诱导本生烟草中甲基化酶、去甲基化酶和7条候选基因表达水平改变。（2）不同浓度Pb2+处理本生烟草引起候选基因所选区域DNA甲基化水平发生变化。（3）候选基因VIGS植物长势明显不如pYY13对照植物,有的甚至出现枯死。测定其中存活的基因对应植株叶绿素含量,发现NbHPT VIGS植物的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量均降低;NbTM VIGS植物的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量均增加,经800 mg·L-1Pb2+处理11天后,VIGS植物与对照植物比较,出现生长抑制,甚至枯死,分别取VIGS植物根、茎、叶,测定Pb2+含量,发现与对照植物相比,NbHPT和NbWRKY VIGS植物根部Pb2+含量明显减少,NbTM VIGS变化不明显;NbHPT VIGS植物茎内所含Pb2+明显高于对照,NbWRKY VIGS则明显低于对照,NbTM VIGS变化不明显;对叶片Pb2+含量测定结果可知,NbHPT、NbWRKY VIGS植物叶片中Pb2+含量明显增加,而NbTM VIGS植物与对照相比差异不明显,说明候选基因沉默后其表达量下调,导致对应植物生长发育受到影响,叶绿素含量发生变化,对Pb2+的耐受能力减弱,Pb2+吸收紊乱。（4）亚细胞定位结果显示:NbDDRP定位在叶绿体、细胞质和细胞核中;NbEF、NbNADH定位于细胞核。NbVAPF没有观察到荧光信号,推测其可能定位于液泡,液泡中pH偏低,影响GFP发光。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1.文献综述
  •   1.1 重金属对生态环境的影响
  •     1.1.1 铅胁迫对植物生长发育的影响
  •     1.1.2 铅胁迫下植物的响应应答
  •   1.2 植物DNA甲基化与重金属胁迫的关系
  •     1.2.1 植物DNA甲基化的产生和维持机制
  •     1.2.2 植物DNA甲基化的特征
  •     1.2.3 植物DNA甲基化的生物学功能
  •   1.3 HPT基因
  •     1.3.1 HPT与生育酚
  •     1.3.2 HPT合成生育酚过程及分类
  •   1.4 WRKY基因
  •     1.4.1 WRKY的种类和起源
  •     1.4.2 WRKY的功能
  •   1.5 研究目的和技术路线
  •     1.5.1 研究目的
  •     1.5.2 技术路线
  • 2.铅胁迫对本生烟草甲基化酶和去甲基化酶的影响
  •   2.1 实验材料与所需设备
  •     2.1.1 材料和试剂
  •     2.1.2 主要仪器
  •     2.1.3 引物
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 总RNA的提取
  •     2.2.2 cDNA的合成
  •     2.2.3 半定量RT-PCR
  •     2.2.4 实时荧光定量PCR
  •   2.3 结果分析
  •     2.3.1 甲基化酶CMT3 表达量变化情况
  •     2.3.2 甲基化酶MET1 表达量变化情况
  •     2.3.3 甲基化酶DRM2 表达量变化情况
  •     2.3.4 去甲基化酶ROS1 表达量变化情况
  •   2.4 小结
  • 3.铅胁迫对候选基因DNA甲基化水平影响
  •   3.1 实验材料与所需设备
  •     3.1.1 实验材料和主要试剂
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 本生烟草基因组DNA的提取
  •     3.2.2 基因组DNA的纯化
  •     3.2.3 重亚硫酸盐处理基因组DNA
  •     3.2.4 构建MS-PCR克隆载体
  •   3.3 结果分析
  •     3.3.1 NbDDRP基因铅胁迫前后甲基化变化情况
  •     3.3.2 NbEF基因铅胁迫前后甲基化变化情况
  •     3.3.3 NbNADH基因铅胁迫前后甲基化变化情况
  •     3.3.4 NbVAPF基因铅胁迫前后甲基化变化情况
  •   3.4 小结
  • 4.候选基因表达与铅的关系
  •   4.1 实验材料与设备
  •     4.1.1 材料和试剂
  •     4.1.2 主要仪器
  •     4.1.3 引物
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 总RNA的提取
  •     4.2.2 cDNA的合成
  •     4.2.3 半定量RT-PCR
  •     4.2.4 实时荧光定量PCR
  •   4.3 结果分析
  • 5.候选基因在植物发育及响应铅胁迫中功能初步分析
  •   5.1 材料与设备
  •     5.1.1 材料和试剂
  •     5.1.2 仪器设备
  •     5.1.3 引物
  •   5.2 实验方法
  •     5.2.1 VIGS表达载体的构建
  •     5.2.2 构建VIGS农杆菌
  •     5.2.3 注射烟草
  •     5.2.4 半定量RT-PCR分析
  •     5.2.5 VIGS植物的叶绿素含量测定
  •     5.2.6 植物对铅的吸收情况
  •   5.3 结果分析
  •     5.3.1 候选基因VIGS植物发育表型分析
  •     5.3.2 VIGS植物半定量RT-PCR分析
  •     5.3.3 VIGS植物的叶绿素含量与其对重金属Pb胁迫能力的比较
  •   5.4 小结
  • 6.亚细胞定位
  •   6.1 材料与设备
  •     6.1.1 引物
  •   6.2 实验方法
  •     6.2.1 pJG188 载体线性化
  •     6.2.2 植物细胞荧光蛋白表达载体的构建
  •   6.3 电击转化法将载体导入农杆菌
  •   6.4 注射烟草
  •   6.5 结果分析
  •     6.5.1 NbDDRP定位情况
  •     6.5.2 NbEF定位情况
  •     6.5.3 NbNADH定位情况
  •   6.6 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 在学研究成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 贺引弟

    导师: 郭江波,辛翠花

    关键词: 甲基化,亚硫酸盐测序,病毒诱导的基因沉默,亚细胞定位

    来源: 内蒙古科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑,农业科技

    专业: 生物学,生物学,环境科学与资源利用,农作物

    单位: 内蒙古科技大学

    基金: 国家自然科学基金(项目号:31660064)

    分类号: X173;Q943.2;S572

    DOI: 10.27724/d.cnki.gnmgk.2019.000291

    总页数: 68

    文件大小: 2003K

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