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基于细菌双杂交的纳米抗体筛选系统的构建及其应用

2020-12-08阅读(247)

基于细菌双杂交的纳米抗体筛选系统的构建及其应用

论文摘要

纳米抗体（nanobody,Nb）,即重链单域抗体VHH（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody）,是目前已知的拥有完全抗原结合能力的最小抗体片段,具有稳定性强、溶解度高、组织穿透性强、易于改造及人源化等优良特性,为其在生物传感器、疾病诊断和治疗等生命科学领域的应用奠定了扎实的基础。目前常规的纳米抗体制备主要依赖于噬菌体展示技术,然而该方法需要对抗原进行纯化,并且需要多次富集以缩小文库来筛选亲和力较强的纳米抗体。为解决上述问题,本研究根据合成生物学原理,利用抗原-抗体相互作用的信号激活抗性基因,实现了特异性纳米抗体的高效筛选,同时克服了免疫文库构建中致死性、高毒性或者低免疫原性等抗原无法进行动物免疫的缺点。本论文首先根据LexA408/LexAWT基因元件构建了新型细菌双杂交系统,该系统主要含有两个质粒pMHA2和pMHN2,分别用于表达目的抗原（Bait）和纳米抗体（Prey）文库。Bait和Prey发生特异性结合可通过嵌合型双抑制子LexA408/LexAWT间接激活抗性基因的表达以筛选出抗原特异性纳米抗体。基于亮氨酸拉链Fos-Jun以及sfGFP-NbsfGFP的阳性对照实验证实该系统的可行性,且严谨性接近100%。在此基础上,利用三核苷酸密码子盒（Trinucleotide cassettes）,构建了VHH插入正确率高且基因多样性丰富的合成文库,库容量达到1.8×109CFU/mL。基于上述构建的筛选系统,分别针对糖化血红蛋白HbA1c、肿瘤坏死因子TNF-α和炭疽毒素保护性抗原PA63,筛选得到共计六种亲和力较强的特异性纳米抗体,并利用ELISA技术对它们进行了亲和力分析。本研究所构建的基于细菌双杂交技术的纳米抗体筛选系统以及相关操作流程,大大简化了纳米抗体的筛选过程,降低了制备成本,并且在免疫文库无法实行时为纳米抗体的筛选拓宽了途径,具有重要的研究意义和应用价值。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 绪论
  •   1.1 纳米抗体的发现过程
  •   1.2 纳米抗体的结构
  •   1.3 纳米抗体的优良特性
  •     1.3.1 优异的理化特性
  •     1.3.2 较低的免疫原性
  •     1.3.3 较强的穿透性
  •     1.3.4 高亲和力和高特异性
  •     1.3.5 高表达性
  •     1.3.6 易于纯化
  •     1.3.7 易于人源化
  •     1.3.8 易于改造与修饰
  •   1.4 纳米抗体的类型
  •     1.4.1 单价纳米抗体（图1.3 a）
  •     1.4.2 多价纳米抗体和多特异性纳米抗体（图1.3 d）
  •     1.4.3 融合型纳米抗体（图1.3 e）
  •   1.5 纳米抗体的制备
  •     1.5.1 纳米抗体筛选技术
  •     1.5.2 纳米抗体文库
  •   1.6 纳米抗体的应用
  •     1.6.1 纳米抗体在诊断领域的应用
  •     1.6.2 纳米抗体在医疗领域的应用
  •   1.7 细菌双杂交系统
  •   1.8 本课题的研究目的及意义
  • 2 细菌双杂交系统的构建
  •   前言
  •   2.1 材料与方法
  •     2.1.1 菌株与质粒
  •     2.1.2 引物
  •     2.1.3 生化试剂
  •     2.1.4 抗生素
  •     2.1.5 仪器与设备
  •     2.1.6 培养基
  •     2.1.7 常用溶液配制
  •     2.1.8 分子生物学操作
  •   2.2 结果与讨论
  •     2.2.1 细菌双杂交系统的构建
  •     2.2.2 利用细菌双杂交系统筛选纳米抗体可行性验证
  •     2.2.3 细菌双杂交纳米抗体筛选系统的优化
  •   2.3 本章小结
  • 3 纳米抗体合成文库的构建
  •   前言
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 菌株与质粒
  •     3.1.2 仪器与设备
  •     3.1.3 引物
  •     3.1.4 抗生素
  •     3.1.5 生化试剂
  •     3.1.6 培养基
  •     3.1.7 常用溶液配制
  •     3.1.8 分子生物学操作
  •   3.2 结果与讨论
  •     3.2.1 纳米抗体人工合成文库的构建
  •     3.2.2 人工合成文库的质量评估
  •   3.3 本章小结
  • 4 细菌双杂交纳米抗体筛选系统的应用
  •   前言
  •   4.1 材料与方法
  •     4.1.1 菌株与质粒
  •     4.1.2 仪器与设备
  •     4.1.3 引物
  •     4.1.4 抗生素
  •     4.1.5 实验试剂
  •     4.1.6 培养基
  •     4.1.7 常用溶液配制
  •     4.1.8 特定抗原的细菌双杂交质粒构建
  •     4.1.9 特定抗原的纳米抗体筛选与纯化
  •     4.1.10 纳米抗体ELISA测试
  •   4.2 结果与讨论
  •     4.2.1 糖化血红蛋白HbA1c的纳米抗体筛选与鉴定
  •     4.2.2 肿瘤坏死因子TNF-ɑ的纳米抗体筛选与鉴定
  •     4.2.3 炭疽毒素保护性抗原PA63 的纳米抗体筛选与鉴定
  •   4.3 本章小结
  • 5 结论与展望
  •   5.1 结论
  •   5.2 展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 杨慕晗

    导师: 汪洋

    关键词: 纳米抗体,细菌双杂交,合成文库,筛选

    来源: 南京理工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 南京理工大学

    分类号: Q503

    DOI: 10.27241/d.cnki.gnjgu.2019.000391

    总页数: 87

    文件大小: 3757K

    下载量: 27

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