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具有大斯托克位移的新型远红色荧光蛋白的分子设计与性能研究

2020-12-02阅读(1027)

具有大斯托克位移的新型远红色荧光蛋白的分子设计与性能研究

论文摘要

荧光蛋白现在已经被广泛应用于生命科学领域,并且为精度较高的亚细胞级别成像技术提供了便利,而650 nm700 nm范围的荧光探针在生物体内的组织内,具有透射率更高,成像时间更长,自发荧光背景弱,光散射率低等优势。而具有大斯托克位移的远红荧光蛋白也成为了荧光蛋白领域内的研究热点。藻胆蛋白作为藻胆体的重要组成部分,可以捕获橙光、红光和远红光来用于蓝藻和红藻的光合作用,而藻胆体核心的藻胆蛋白如别藻蓝蛋白则可以吸收远红光,从而将能量传递到反应中心。因此别藻蓝蛋白的亚基可以被设计成一些远红荧光蛋白,例如嗜热藻Chroococcidiopsis thermalis PCC7203的中藻胆体核亚基ApcF2优化发展而来的可以结合BV色素的远红荧光蛋白BDFP1.2/1.6等系列。但是目前的荧光蛋白的斯托克位移都比较小,这极大地限制了在细胞内多色成像的应用。mCherry是一个被广泛应用的优良的红色荧光蛋白,因为其有着较高的荧光量子产率而可以作为FRET中的能量供体,从而将能量有效地传递给能量受体例如BDFP1.6等远红荧光蛋白。我们将mCherry与BDFP1.6荧光蛋白通过不同的方式进行融合尝试,得到了一个具有大斯托克位移的新型荧光蛋白BDFP2.0。BDFP2.0可以被580 nm的激发光激发,然后将能量有效地传递给BDFP1.6,从而使得BDFP2.0在远红区范围内的哺乳动物细胞有效亮度也得到了有效的提升,并且具有耐酸碱、耐化学变性剂等特点,我们将BDFP2.0与不同的目的蛋白进行融合,转染HeLa细胞后,得到了清晰明亮的高分辨率的照片,而且与BDFP1.1同时转染了HeLa细胞,得到了可以明显区分的高分辨双色成像照片。所以BDFP2.0不仅仅是一个动物细胞结构的标记物,而且也是在双色成像中也有着优良表现的荧光蛋白。同时,BDFP2.0的出现也为FRET定量分析提供了借鉴和为研究者们开发新型荧光蛋白提供了一些新的思路。在对亚基ApcF2进行分子改造的过程中,获得了一个具有特殊光谱特点的突变体ApcF2-12,其产量较低但具有两个吸收峰值,通过随机诱变的方法将ApcF2-12进行诱变筛选,不仅仅获得了产量较高的突变体,同时也得到了其他具有特殊荧光光谱,例如斯托克位移增大和光谱蓝移的一些突变体,并且进行了测序比对,尝试对其光谱的变化进行了一些分析。通过对ApcF2-12进行分子改造,确定了突变率较为稳定和克隆成功率较高的随机诱变方法,丰富了筛选优秀荧光探针的诱变体来源,也为研究藻胆蛋白结合BV色素的荧光变化提供了一些参考和思路。来自于Synechococcus sp.PCC7335的核膜连接蛋白ApcE2的N端结构域（1-273）可以与PEB/PCB自催化地非共价结合,从而使得荧光光谱红移。我们通过尿素变性和酶解两种蛋白质变性方法以及丁酮和氯仿两种萃取剂对色素进行萃取,摸索出一种价格低廉,萃取效率较高并且操作简便毒性较小的色素萃取方法。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略词表
  • 1 序言
  •   1.1 蓝藻的光合作用
  •     1.1.1 蓝藻
  •     1.1.2 藻胆体和光合作用
  •     1.1.3 藻胆蛋白
  •     1.1.4 胆色素的生物合成
  •   1.2 荧光蛋白的研究进展
  •     1.2.1 GFP绿色荧光蛋白家族
  •     1.2.2 DsRed橙红色荧光蛋白家族
  •     1.2.3 红外荧光探针
  •     1.2.4 荧光探针的应用
  •   1.3 激光共聚焦显微成像技术
  •   1.4 大斯托克位移荧光探针的研究
  •   1.5 本研究课题的目的和意义
  • 2 基于FRET原理的大斯托克位移荧光探针的研究
  •   2.1 引言
  •   2.2 材料与仪器
  •     2.2.1 主要材料
  •     2.2.2 主要试剂
  •     2.2.3 实验仪器
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 PCR扩增目的片段以及原核表达质粒的构建
  •     2.3.2 感受态细胞的制备
  •     2.3.3 阳性克隆子的筛选
  •     2.3.4 融合蛋白的表达、破碎与纯化
  •     2.3.5 融合蛋白的紫外可见光谱及荧光光谱测定
  •     2.3.6 SDS-PAGE和锌电泳
  •     2.3.7 融合蛋白荧光寿命测定
  •     2.3.8 融合蛋白pH稳定性检测
  •     2.3.9 融合蛋白盐酸胍稳定性检测
  •     2.3.10 融合蛋白体外光稳定性的检测
  •     2.3.11 融合蛋白热稳定性检测
  •     2.3.12 融合蛋白在大肠杆菌中成熟速率测定
  •     2.3.13 荧光蛋白聚集态的分析
  •     2.3.14 动物细胞的培养与转染
  •     2.3.15 动物细胞表达质粒的构建
  •     2.3.16 荧光蛋白在细胞内亮度的比较
  •     2.3.17 高分辨率激光共聚焦扫描显微成像
  •   2.4 结果与分析
  •     2.4.1 荧光光谱分析
  •     2.4.2 融合蛋白荧光寿命分析
  •     2.4.3 融合蛋白pH稳定性研究
  •     2.4.4 融合蛋白耐盐酸胍和光稳定性的研究
  •     2.4.5 融合蛋白热稳定和成熟速率的研究
  •     2.4.6 融合蛋白聚集态的研究
  •     2.4.7 动物细胞HEK293T中有效亮度的比较
  •     2.4.8 动物细胞HeLa中高分辨率成像
  •   2.5 本章小结
  • 3 基于ApcF2 的荧光探针的进化研究
  •   3.1 引言
  •   3.2 材料与仪器
  •     3.2.1 主要材料
  •     3.2.2 主要试剂
  •     3.2.3 实验仪器
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 诱变库的建立
  •     3.3.2 诱变库的筛选
  •     3.3.3 诱变库的表达以及光谱测定
  •     3.3.4 摩尔消光系数和荧光量子产率参数的计算
  •     3.3.5 诱变体序列测定
  •     3.3.6 诱变体序列比对
  •   3.4 实验结果
  •     3.4.1 提高阳性克隆率的分析
  •     3.4.2 Qpix420 筛选结果以及分析
  •     3.4.3 诱变体的光谱分析
  •     3.4.4 诱变体的序列分析
  •   3.5 本章小结
  • 4 不同方法萃取PEB/PCB色素
  •   4.1 引言
  •   4.2 材料与仪器
  •     4.2.1 主要材料
  •     4.2.2 主要试剂
  •     4.2.3 实验仪器
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 细胞的表达和提纯
  •     4.3.2 蛋白的变性
  •     4.3.3 色素的萃取
  •   4.4 实验结果
  •     4.4.1 不同方法的萃取效果分析
  •   4.5 本章小结
  • 参考文献
  • 附录 A已发表的论文
  • 附录 B附图
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 赵宝清

    导师: 赵开弘

    关键词: 远红光,斯托克位移,融合蛋白,生物标记,分子进化

    来源: 华中农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 华中农业大学

    分类号: Q5-3

    DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000174

    总页数: 118

    文件大小: 8500K

    下载量: 117

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