降解全氟辛酸真菌的分离及降解分子机理初探

论文摘要

全氟辛酸（PFOA）是一种典型的全氟有机化合物（PFCs）,广泛应用于纺织、化工、机械、医药、电子和航空等领域。由于其具有持久性、生物积累性和生物毒性,近些年在各种环境介质中被检测到,严重威胁生态安全和人类健康。PFOA作为一种新型的持久性有机污染物,其修复治理成为环境科学领域研究热点之一,而生物降解作为一种环境友好型、经济节约型修复技术具有广阔的应用前景。本研究首先经过富集培养和梯度驯化,从某氟化物工厂污染的土壤中分离获得2株能以PFOA为唯一碳源生长的真菌（编号为AF1和AF2）。基于形态特征和ITS序列的系统发育分析,初步鉴定2株真菌分别属于棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）和棘卷枝毛霉（Mucor circinelloides）。研究2株真菌的生长特性发现菌株AF2具有生长优势,最大生物量相比真菌AF1高;采用LC-MS测试这些株菌降解PFOA能力,结果表明真菌AF1和AF2在以PFOA为唯一碳源的无机盐培养基中发酵96 h后,PFOA降解率最大,分别为23.24±1.26%和28.12±1.45%。接着,研究了优势降解菌AF2对PFOA耐受性和胁迫生理响应。测定真菌AF2在PFOA浓度为0、1000、1500、2000 mg/L的PDB培养基中的生长情况,发现其对PFOA耐受的最高浓度为1500 mg/L;菌株AF2的SOD、GSH活力,MDA含量随着PFOA胁迫浓度（0、300、600 mg/L）的升高显著增加,高浓度PFOA（900mg/L）的胁迫使MDA含量、SOD和GSH活力降低。结果表明菌株AF2具有较高的PFOA耐受性,但过高浓度的PFOA能对降解菌AF2产生氧化胁迫和膜损伤。以含有或未有PFOA的改良无机盐培养基发酵真菌AF2,分别收集培养96 h和120 h的真菌菌体（即P96、C96、P120、C120四组）,进行转录组测序和比较转录组分析。通过数据的过滤和拼接组装,共获得5,8181条Unigene,总长度为3854,1574 bp;转录本功能注释发现有4,8731条Unigene能被注释到各个数据库中。通过处理组和对照组的差异表达基因分析,发现P96和C96比较组共有2000个差异基因,其中694个基因上调表达,有1306个基因下调表达;P120和C120比较组共有1244个差异基因,其中551个基因上调表达,693个基因下调表达。通过两个比较组的差异基因注释,发现16个共同的差异基因被注释到异源物降解和代谢通路中,推测为真菌AF2降解PFOA相关的候选功能基因。总之,本研究首次分离获得2株降解PFOA的真菌,其中真菌AF2为降解PFOA优势菌株;PFOA氧化胁迫测试发现降解菌AF2具有较高的PFOA耐受能力,推测是一株有较好降解PFOA潜能的微生物菌种。同时,开展了两种发酵条件下真菌AF2的比较转录组学研究,初步获得16个与PFOA降解相关的候选基因。项目的开展为持久性有机污染物PFOA的微生物降解积累了种质资源,为阐明微生物降解转化PFOA的分子机制提供了科学数据。

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摘要

ABSTRACT

第1章前言

1.1 PFOA概述

1.1.1 全氟化合物简介

1.1.2 PFOA污染及分布

1.1.3 PFOA生物毒性

1.1.4 PFOA污染修复

1.2 转录组测序

1.3 研究目的与意义

1.4 研究内容

第2章 PFOA降解菌的分离与鉴定

2.1 实验材料

2.1.1 样品采集

2.1.2 主要试剂与仪器

2.1.3 培养基

2.2 实验方法

2.2.1 降解菌的筛选

2.2.2 PFOA降解真菌菌株鉴定

2.2.3 PFOA降解真菌生长曲线测定

2.2.4 真菌降解PFOA能力测试

2.2.5 PFOA检测方法

2.2.6 数据统计

2.3 结果与分析

2.3.1 降解菌株的分离鉴定

2.3.2 降解PFOA真菌的生长曲线

2.3.3 真菌降解PFOA能力

2.4 讨论

2.5 小结

第3章降解菌AF2对PFOA的耐受性及生理响应

3.1 实验材料

3.1.1 主要试剂与仪器

3.1.2 培养基

3.2 实验方法

3.2.1 真菌AF2对PFOA的耐受性

3.2.2 样品制备

3.2.3 蛋白质测定

3.2.4 SOD测定

3.2.5 谷胱甘肽-S转移酶（GST）测定

3.2.6 MDA测定

3.2.7 数据处理

3.3 结果与分析

3.3.1 真菌AF2对PFOA耐受性

3.3.2 真菌AF2 可溶性蛋白质测定

3.3.3 PFOA对降解菌SOD活力的影响

3.3.4 PFOA对降解菌GST活力的影响

3.3.5 PFOA对降解菌MDA含量的影响

3.4 讨论

3.5 小结

第4章 PFOA降解菌转录组测序及其数据分析

4.1 实验材料

4.1.1 实验材料和仪器

4.1.2 培养基

4.2 实验方法

4.2.1 样品制备

4.2.2 测序数据质量评估及质控

4.2.3 转录本拼接

4.2.4 基因功能注释

4.2.5 基因表达水平分析

4.2.6 基因差异表达分析

4.2.7 差异基因功能注释

4.2.8 差异基因功能富集分析

4.3 结果与分析

4.3.1 原始数据质量评估

4.3.2 数据质控

4.3.3 转录本拼装结果

4.3.4 基因功能注释结果

4.3.5 转录本GO注释分类

4.3.6 转录本KOG注释分类

4.3.7 KEGG功能分类注释

4.3.8 差异表达基因分析结果

4.3.9 差异基因功能注释

4.3.10 候选基因

4.4 讨论

4.5 小结

第5章结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

作者在学期间取得的学术成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 周璐璐

导师: 彭清忠,易浪波

关键词: 真菌,分离,鉴定,氧化胁迫,转录组测序

来源: 吉首大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 吉首大学

分类号: X172;X505

DOI: 10.27750/d.cnki.gjsdx.2019.000198

总页数: 56

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