付光宇[1]2004年在《人胰岛素化学发光检测方法的建立及临床应用》文中认为糖尿病是一种由于胰岛功能障碍导致血糖失控造成的全身性进行性疾病,近年来,随着人们生活水平提高,生活方式的改变及人口寿命的延长,糖尿病发病率迅速增长,据最近的流行病学调查显示,我国的糖尿病发病率已由20年前的0.67%上升到近年来的3.21%,糖尿病患者的人数已居世界第二位(仅次于美国),据初步统计我国糖尿病患者总数约4,000万人,已成为严重的公共卫生问题和社会问题。为此,国家卫生行政管理部门提出糖尿病的防治工作是目前和今后疾病控制工作的重点之一。引起糖尿病的根本原因是人体胰岛功能受体缺陷,引起胰岛B细胞受损,胰岛素分泌相对或绝对不足而导致的一种慢性内分泌代谢性疾病,血糖的升高只是一种临床症状。因此,及早发现胰岛细胞损伤,尽快恢复胰岛细胞的功能,是预防和治疗糖尿病的关键。测定血清胰岛素水平可作为胰岛B细胞分泌功能的重要指标,对判断胰岛B细胞的生理功能及糖尿病、胰岛素瘤和胰岛素抵抗综合征等有关疾病的早期诊断、疗效观察、发病机理以及临床和基础研究都有重要的价值。当前国内对胰岛B细胞功能的体外检测多采用的是放射免疫方法和进口全自动化学发光检测。由于放射免疫方法存在试剂寿命短、检测时间长、试剂稳定性差、需要昂贵仪器并有放射性污染等先天性缺陷而限制了它的推广和普及,特别在胰岛素测定方面,主要表现是特异性差,难以排除胰岛素原及其他胰岛素类似物的干扰,测定结果反映的是“反应胰岛素”,而非真胰岛素,不能确切地判断B细胞的功能状态。进口的全自动化学发光检测的成本又十分昂贵,病人难以承受的,国内化学发光检测试剂的研究刚刚起步,产业化方面更是空白。本研究自2000年立项,2001年获河南省重大科技攻关项目(0322030500),历经叁年时间完成了该试剂盒的研制工作,为临床提供了一种新型的血清胰岛素检测方法。硕士学位论文人胰岛素化学发光检测方法的建立及临床应用材料与方法:首先建立化学发光检测方法,采用HRP一LuminOI增强酶促化学发光体系,通过试验确定HRP一Luminol增强酶促化学发光最佳反应条件。然后将其与胰岛素免疫检测方法相结合,建立双抗体夹心胰岛素化学发光检测法,并用该方法检测151例正常体检者和234例糖尿病患者等1 572份临床血清样本,同时和目前使用的放射免疫检测试剂进行比较。统计学方法:数据以均数士标准差(夏士s)表示,用百分位数法、方差分析、回归分析及t检验进行分析处理。部分数据作直线相关分析。结果:l、确定了化学发光底物的组成以及最佳条件:鲁米诺的最佳浓度为smmollL,HZOZ的浓度为3 mmollL,对碘苯酚的浓度为7mmollL,保护剂A的浓度为smmollL,保护剂B为1 .smg加L。2、建立了HRP一LUMINOL化学发光免疫反应技术平台,该技术发光强度高,灵敏度>,。一,smollL,线形范围1。一10一18 mollL,发光平台期达60分钟,可满足临床检测的高灵敏、宽检测范围的要求。3、建立了人真胰岛素化学发光定量检测试剂,其灵敏度为0.smU几,线形范围为1.5一160 mU/L,特异性好,和胰岛素原(Zooopmo巩)、C一肤(s000pmol/L)和胰岛素类似物(ZO00pm。讥)无交叉反应,平均回收率为101.7%,批内、批间变异(CV)为4.7%、7.0%。和放免试剂同时测定血清样本1572份,两种方法测定结果高度相关(r二0.9502)a结论:建立的胰岛素化学发光定量检测试剂,特异性强,和胰岛素原、胰岛素类似物无交叉反应;双抗体夹心法取代竞争法,灵敏度高;检测的是真胰岛素,能真实反映胰岛B细胞功能,适合临床指导糖尿病的早期诊断和治疗。
陈超, 彭波, 李基[2]2015年在《人胰岛素定量测定试剂盒化学发光免疫分析法的建立及方法学评价》文中进行了进一步梳理目的建立了一种定量测定人血清中胰岛素的化学发光免疫方法 ,并对其试剂盒性能进行方法学评价。方法试剂盒采用双抗体夹心法,以磁微粒交联的单抗作为捕获抗体,碱性磷酸酶标记的单抗作为检测抗体,分别对本试剂盒的溯源性、参考范围、最低检测限、线性、准确度、精密性、分析特异性、抗干扰性、药物影响及样本比对方面进行评价。结果用胰岛素NIBSC国际标准品(66/304)进行溯源,相关性方程为y=1.0335x+0.3349,相关系数r=0.999;建立了健康人群空腹血清胰岛素参考范围,覆盖2.5%~97.5%百分位数人群的参考值范围为1.59μIU/m L~14.64μIU/m L;对此方法建立的试剂进行了方法学评价,最低检测限可达0.08μIU/m L;线性在0μIU/m L~300μIU/m L内,相关系数r=0.9999;精密性CV<8%;准确度在±10%之内;当样本中的胰岛素浓度为200 000μIU/m L时,未发现钩状效应;与Roche电化学发光系统测定结果显着相关,相关方程为y=0.9541x+0.177,相关系数r=0.9917,两种方法学的测定结果具有较高的一致性。结论本研究建立的人胰岛素化学发光免疫分析定量检测试剂盒的各项性能指标均达到了临床检测要求,可用于临床血清胰岛素的检测。
王鑫娟[3]2007年在《口服胰岛素龙血竭纳米球制剂的研究》文中研究说明糖尿病是威胁人类健康的重大疾病之一,目前治疗Ⅰ型糖尿病最有效的药物是胰岛素。临床上胰岛素的使用方式为注射,且为终生给药,这种给药方式给病人带来了极大的痛苦与不便。为此,本研究开发了胰岛素的口服纳米制剂——胰岛素龙血竭纳米球(ISDN)。传统中药龙血竭(SD)具有活血化淤,消肿止痛,止血补血之功效,临床上龙血竭可用于治疗糖尿病足;另外,有研究表明龙血竭也具有一定的降血脂、血糖效果,可作为糖尿病的辅助治疗药物。本文选择龙血竭为壁材,采用沉淀法包裹胰岛素,制成ISDN,并添加β-环糊精(β-CD),进一步制成口服粉剂,同时对制备工艺及其参数进行了优化考察,确定了最优的制备工艺,并建立了胰岛素在ISDN中的高效液相色谱(HPLC)的检测方法,最后还对ISDN的口服降血糖效果作了初步的研究。采用HPLC法测定ISDN中胰岛素的含量。样品的检测采用Phenomenex C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以0.1mol·L~(-1)磷酸二氢钠溶液—乙腈为流动相,在前15 min以72-28的比例进行等度洗脱,之后进行梯度洗脱,流速为1.0mL·min~(-1),检测波长为210 nm,柱温30℃。结果表明:胰岛素在5～200μg·mL~(-1)范围内,峰面积与浓度成良好线性关系(r=0.9999),平均回收率为99.2%,平均日内、日间精密度分别为0.4、0.7。以扫描和透射电镜观察微粒的外形,粒度分析仪分析其平均粒径及分布宽度,HPLC法检测其胰岛素含量。结果表明:ISDN微粒外形为球形,平均粒径为114±13 nm,平均包封率为63.6±5.4%,平均载药量为9.3±0.2 IU·mg~(-1)。体外释放研究表明,ISDN及ISDN-β-CD粉剂均具有缓释效果。糖尿病小鼠口服不同剂量ISDN-β-CD,结果显示:50 IU·kg~(-1)、70 IU·kg~(-1)和90 IU·kg~(-1)均有降血糖效果,而30 IU·kg~(-1)无效果。与皮下注射胰岛素相比,口服制剂的药效更持久。
吴在荣, 王宏锐[4]2010年在《链霉亲和素-生物素化学发光免疫分析血清胰岛素方法建立及临床应用》文中提出目的:建立链霉亲和素-生物素双抗体夹心一步法测量人胰岛素化学发光免疫分析方法,并进行临床应用检测。方法:以链霉亲和素包被微孔板,生物素化一株单克隆抗体,辣根过氧化物酶标记另一株单克隆抗体。校准品与胰岛素国家标准品进行溯源,建立免疫分析方法,进行性能参数测试。收集40例正常人、12例1型、29例2型糖尿病人血清,统计整理参考值,并与国外同类试剂盒进行对比。结果:该方法回收率94.13%,线性范围(2～200)μIU/ml,灵敏度0.05μIU/ml,批内、批间变异系数(CV)分别为2.87%～7.06%和3.24%～9.14%,与牛胰岛素、猪胰岛素、人前胰岛素原、胰岛素样生长因子Ⅰ交叉反应率分别为27.2%、19.7%、0.16%、0.07%,与C肽、胰高血糖素、生长抑素无交叉反应。本法与国外同类试剂盒同时检测40份正常人葡萄糖耐量试验血清,r为0.9869,本法37℃7d热稳定性良好,建立一组正常人葡萄糖耐量参考值。结论:本法各项指标均满足临床检测要求,达到国外同类产品水平,反应快速,操作简单,便于临床检验应用。
钮心怡, 路晟, 孙旭东, 江振友[5]2007年在《C肽化学发光免疫诊断分析方法的建立及临床应用》文中研究指明目的:建立一种特异、敏感的临床C肽的化学发光免疫分析诊断方法并应用于临床。方法:采用特异性的两株C-P单克隆抗体,辣根过氧化物鲁米诺酶促增敏化学发光体系,利用双抗体夹心法检测。结果:敏感度为0.02μg/L;检测线性范围为0.02~20μg/L;多人次检测证实试剂盒批内变异均小于10%,分析间变异小于15%;与18μg/L人胰岛素原、2 000 m IU/L的人胰岛素无显着交叉反应。结论:该方法灵敏度高,特异性好,稳定性强,检测范围宽,有良好的准确性和重复性,适合应用于临床。
罗丽荣[6]2007年在《化学发光成像分析的研究》文中认为化学发光(Chemiluminescence，CL)分析因其具有仪器设备简单、检出限低和线性范围宽等优点，已被应用于环境科学、临床医学、药学、生命科学、材料科学等领域。伴随着CL分析的发展，CL信号的检测技术取得明显进步，既可以利用传统的光电倍增管(Photomultiplier，PMT)测CL信号，也可以利用具有高灵敏度、高分辨率的CL成像装置检测发光信号，利用CL成像技术可对低至单光子水平的光进行定位及定量检测。当发光信号的空间分布体现了重要的分析信息时，成像检测技术更有优势。本论文的研究工作主要由化学发光阵列成像平台的建立；化学发光免疫成像分析和自发电池激发的电化学发光成像分析叁大部分构成。1化学发光阵列成像平台的建立CL成像分析主要包括微孔版、微阵列及微型化装置中的定量检测；基于酶、免疫组织化学和原位杂交反应的显微成像分析；生物体的发光成像分析等。然而，CL成像不同于荧光成像，在进行荧光成像时，在一定波长光的激发下，产生稳定的光信号，光信号不随时间而变化，我们可在任一段时间内积分，获得荧光强度，然而，CL信号是时间的函数，CL强度随时间而改变。大多数CL反应是快反应，发光在数秒内便完成，因为反应的引发与数据采集间存在延迟时间，利用传统的的CL成像方法不能检测这样的快反应。因而现有的CL成像分析只能够检测一些慢CL反应，或者将快发光反应转化为慢发光反应才能进行成像。例如辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)催化的鲁米诺与H_2O_2间的CL反应是快发光反应，不适合成像分析，通常要加入对碘苯酚等增强剂增强发光强度并延长发光时间。然而，很难将多数快CL反应转变为慢反应。即使将一些慢发光反应用于成像分析，最大发光强度仍然不能被CCD捕获到。例如，加入增强剂的鲁米诺／H_2O_2／HRP体系，在几十秒内，发光强度迅速增加并达到最大值，随后缓慢的降到与背景值相当的数值。然而，在几十秒内，操作者很难将所有CL试剂手动地加入到96孔、384孔酶标板或微阵列系统中，CL反应过程的信号不能全部被记录下来，在已开始反应的孔中，最大发光信号将被错过。这将导致检测发光信号的灵敏度相对较差。并且，如果采用手动加样方式将CL试剂加到微孔板或微阵列中，由于CL反不能在同一时间被引发，将导致CL信号的重现性较差。即使采用自动加样系统，反应的引发及信号采集之间的延迟时间仍然存在，这是传统CL成像方法存在的问题。我们利用鲁米诺／血红蛋白／对碘苯酚CL反应体系作为模型，建立了一种新的在线调控的CL阵列成像平台，解决上述问题。众所周知，在碱性介质中，鲁米诺能产生很强的CL信号，而在酸性条件下，不能产生CL信号。所以，我们设想可以通过控制反应的pH值引发并控制CL反应。最终的实验结果表明利用本方法提高了检测的灵敏度。这种反应可控的CL成像分析平台的建立，将使快CL反应的成像检测成为可能。(1)反应可控的化学发光成像分析的设计及应用设计了反应可控的CL成像分析方法。本方法通过控制反应的pH值引发CL反应，并获得了很高的灵敏度。反应的pH值由在线产生的氨气调节，氨气由NaOH溶液与NH_4Cl溶液反应产生，氨气的量可以通过改变NaOH溶液的浓度，进样时间及流速来调节，也可以通过改变NH_4Cl溶液的浓度来控制。96孔酶标板各孔中的CL试剂吸收氨气后，pH值从相同的起始值持续增加，相对CL强度随pH值增加而增加。基于以上的设计，96孔酶标板上的CL反应在同一时间被引发，每孔中整个CL反应过程的信号可以被记录下来。从而获得高的灵敏度及良好的重现性。试验了鲁米诺／H_2O_2CL体系，用于测定血红蛋白(Hb)。CL强度与Hb浓度在1.0×10~(-9)～1.0×10~(-7)mol／L范围内呈线性，检出限为3.0×10~(-10)mol／L(3s)，对1.0×10~(-8) mol／L的Hb进行11次平行测定，相对标准偏差(R．S．D．)为2.7％。2化学发光免疫成像分析本论文的第二部分的研究工作主要由两部分内容构成：基于鲁米诺增强化学发光(ECL)体系的免疫成像分析和基于草酰酯CL反应的免疫成像分析。并应用到重组人肿瘤坏死因子a(rhTNF-a)，金黄色葡萄球菌肠毒素C_1(SEC_1)，白介素6(rHuIL-6)和β-人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)的检测。(1)化学发光成像分析法检测人血清中的肿瘤坏死因子a设计了一种简单、灵敏、高通量的分析方法用于重组人肿瘤坏死因子(recombinant human tumor necrosis factor-a，rh TNF-a)的检测。本法具有酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)法的特异性、增强化学发光法(ECL)的高灵敏度及CL成像分析高样品通量等优点。透明的96孔板被用做固相载体。基于ELISA分析法中双抗体夹心法的原理，将对rh TNF-a抗原具有特异结合能力的一种抗体作为包被抗体，另一被辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体作为酶标抗体。一台带有低温冷却装置的CCD成像系统被用于检测CL信号。CL强度值与rh TNF-a浓度在9.0～312.0 pg／mL范围内呈良好线性关系，检出限为1 pg／mL(3s)。本法已被成功地用于人血清中的rh TNF-a的检测，对78.0 pg／mL rh TNF-a 8次平行测定结果的R．S．D．为4.7％，利用标准加入法所得回收率结果为94.0～108.2％，实验结果表明本方法具有实际应用的可行性。(2)化学发光免疫成像分析法测定牛奶和水中的金黄色葡萄球菌肠毒素C_1设计了一种灵敏、简单、快速及高通量的方法测定金黄色葡萄球菌肠毒素C_1(staphylococcalenterotoxin C_1，SEC_1)，本方法具有ELIsA法的特异性，增强化学发光分析法(ECL)的高灵敏度，及成像分析法高通量检测的优势。基于双抗体夹心法的免疫反应原理，以96孔酶标板作为固定化载体。用一台商品化的带有低温冷却装置的CCD成像系统检测CL信号。在最佳实验条件下，发光强度值与SEC_1浓度在8.0～125.0 ng／mL范围内呈良好线性关系(r~2=0.9976)，检出限为0.5 ng／mL(3s)，对25.0 ng／ml SEC_18次测定结果的R．S．D．为6.0％。将本方法用于检测牛奶和水中SEC_1含量，测定结果与ELISA法相吻合。(3)以纳米金为载体的化学发光免疫成像分析的研究及应用以微孔板为载体的ELISA分析因其具有的高灵敏度和好的特异性被广泛应用于免疫分析。聚苯乙烯因其具有光学透明性并且表面性质可改变，成为应用最为广泛的固定相载体。未修饰的聚苯乙烯表面带有长的碳氢链，会排斥水及亲水性分子，吸引疏水性分子。大的亲水性分子一般都带有疏水链，会使分子吸附在聚苯乙烯表面。但需要很长的孵育时间、较高的物质分子浓度和严格的控制温度等条件，以防止物质分子从聚苯乙烯表面被洗脱下来。因此，亟需建立更好的的固定化方法以满足免疫分析的需求。纳米金因其比表面积大、生物兼容性好及表面自由能高，已在生物试剂的固定化及免疫分析等领域得到广泛应用。本文设计了一种以纳米金为载体固定蛋白质的新方法。纳米金和蛋白质形成的生物复合材料被成功地固定在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)片和聚苯乙烯微孔板上。蛋白质可被高密度地固定在固相载体上并较好地保留生物活性。基于以上设计，建立了利用CL成像检测H_2O_2及重组人白介素-6(rHu IL-6)的分析方法。本方法的线性范围和包被效率与直接固定蛋白的CL成像分析相比，都有显着提高。在选定的实验条件下，CL强度与H_2O_2浓度在1.0×10~(-6)～1.0×10~(-4)mol／L呈线性关系，与rHu IL-6浓度在2.0～312.0 pg／mL呈线性关系，检测H_2O_2的检出限为2.0×10~(-7)mol／L(3s)，rHu IL-6的检出限为0.5pg／mL，对3.0×10~(-5) mol／L的H_2O_26次测定结果的R．S．D．为3.8％，对39.0 pg／mLrHu IL-6 6次测定结果的R．S．D．为4.4％。将本方法用于人血清中rHuIL-6的检测，结果令人满意。(4)化学发光成像分析法检测人血清中的自介素6(rHuIL-6)众所周知，鲁米诺CL体系的发光量子产率不超过5％，而双[2，4，6-叁氯苯基】草酰酯(TCPO)=H_2O_2-荧光剂CL体系具有较高的发光量子产率，通常可达30％。本文建立了一种新的化学发光免疫分析(CUA)方法，结合了传统ELISA方法和双[2，4，6-叁氯苯基]草酰酯(TCPO)-H_2O_2CL体系的优点。邻苯二胺(OPDA)与H_2O_2在HRP催化下反应生成荧光物质2，3-二氨基吩嗪(DAPN)。DAPN被TCPO和H_2O_2反应的中间产物激发产生CL信号，本文研究了所产生的CL信号强度与抗原浓度间的关系。作为方法的分析应用，将本方法用于检测rHuIL-6．在最优化的实验条件下，CL强度与rHu IL-6浓度在4.0～625.0 pg／mL呈线性关系，检测rHu IL-6的检出限为0.5 pg／mL，检测78.0 pr／mL rHu IL-6的R．S．D．为2.3％，将本方法用于测定人血清中rHu IL-6，结果令人满意。(5)化学发光成像分析法检测β-人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)本文采用一种灵敏、简单的方法，可实现对β-HCG的高通量检测。本法具有ELISA方法的特异性、双[2，4，6-叁氯苯基]草酰酯(TCPO)-H_2O_2 CL体系的高灵敏度及CL成像分析高样品通量等优点。邻苯二胺(OPDA)与H_2O_2在HRP催化下反应生成荧光物质2，3-二氨基吩嗪(DAPN)。DAPN被TCPO和H_2O_2反应的中间产物激发产生CL信号，本文研究了所产生的CL信号强度与抗原浓度间的关系。作为方法的分析应用，将本方法用于检测β-HCG。在最优化的实验条件下，CL强度与β-HCG浓度在12.5～400.0 mIU／mL呈线性关系，检测β-HCG的检出限为3 mIU／mL，对50.0 mIU／mLβ-HCG 9次平行测定结果的R．S．D．为3.9％。将本方法用于测定尿液中β-HCG的含量，结果令人满意。3自发电池激发的电化学发光成像分析电化学发光(Electrogenerated chemiluminescence，ECL)也称电致化学发光，是电化学反应过程中产生的激发态分子返回基态产生的光辐射，已成为分析化学中重要且有价值的检测方法。目前，文献报道的ECL分析都是使用外加的电源来实现ECL的激发，这就限制了ECL检测系统的微型化。及其在微全分析系统中的进一步应用。我们设想能否不使用任何外加电源便可实现ECL的激发?我们曾经设计了微型自发原电池为鲁米诺体系及钙黄绿素的电化学发光提供激发电位。大大的简化了ECL的设备，在ECL系统的微型化方面，迈出了新的步伐。金属Al，Zn，Cr，Cd等可作为阳极，Cu，Ag，Au，Pt及石墨等可作为电池的阴极。最后选择Al作为自发原电池的阳极，Ag作为阴极。可通过改变流动试剂的组成或用其他金属替换Al和Ag电极对调节电池的电位。在后续的工作中，进一步研究了Cu／zn合金形成的自发原电池。Cu／Zn合金自发原电池可以为鲁米诺电化学发光提供稳定的电位，将Cu／zn合金颗粒单独置于96孔板中形成自发电池传感器阵列，并利用鲁米诺／H_2O_2CL，体系验证传感器的性能。自发电池传感器阵列具备以下几个优点：首先，不需要为ECL的产生提供外加电源，这有利于仪器的简单化及ECL检测在微阵列中的应用。其次，因为这些传感器利用廉价的仪器很容易制备，可实现传感器的低成本制作。再次，Cu／Zn合金传感器贮备方便，有效使用寿命大于100h。为了形成可任意使用的传感器阵列，使用了酶标板。(1)自发电池激发的电化学发光传感器的研究及应用研究了一种新型的电化学发光(ECL)成像阵列传感器并将其用于H_2O_2的测定。此传感器基于Cu／zn合金自发电池产生的ECL。在碱性溶液中，Cu／Zn合金由于金属腐蚀效应形成自发电池，此电池可为鲁米诺的ECL的产生提供稳定的电位，产生的弱的ECL信号可被H_2O_2增敏。将Cu／Zn合金的颗粒置于96孔板的微孔中形成自发电池传感器阵列。相对ECL强度与H_2O_2浓度在1.0×10~(-6)～1.0×10~(-4)mol／L范围内呈线性关系，检出限为3.0×10~(-7)mol／L(3s)，对1.0×10~(-5)mol／L的H_2O_2进行11次平行测定，相对标准偏差(R．S．D．)为4.0％。
刘路[7]2016年在《抗胰岛素单克隆抗体和多克隆抗体的制备》文中研究指明胰岛素是生物体内非常重要的降糖激素,它是糖尿病诊断、糖尿病相关研究及糖尿病治疗药物研发等过程中重要的检测指标和研究靶点。因此,检测胰岛素水平是必需的技术要求。目前,用于检测胰岛素含量的方法大都基于抗原抗体特异性反应的原理,因此制备高效、特异的抗胰岛素单克隆抗体和多克隆抗体是建立胰岛素检测方法的重要基础。在本研究中,我们制备了抗胰岛素单克隆抗体和多克隆抗体,并对抗体的特性进行初步研究,得到以下结果。1.检测抗胰岛素抗体水平的间接ELISA方法条件的优化。在进行阳性克隆筛选前我们要对测定抗体水平的间接ELISA方法的条件进行优化。本研究中我们分别从抗原包被浓度、小鼠血清稀释比例、封闭液种类、封闭时间、血清作用时间、酶标抗体稀释比例和孵育时间等反应条件进行了优化。优化结果如下:抗原最佳包被浓度为5μg/mL,小鼠血清最优稀释比例为1:100,最佳封闭液为1%BSA,其最优封闭时间为2 h,血清最佳作用时间为1.5 h,酶标抗体最佳稀释比例为1:6000,其最优作用时间为30 min。2.抗胰岛素单克隆抗体的制备。首先,我们用商品化的猪胰岛素作为抗原,采用背部多点注射和腹腔注射的方式免疫BALB/c小鼠,刺激小鼠产生免疫反应。叁次免疫后,通过间接ELISA方法检测小鼠血清效价,优先选择效价高的小鼠进行加强免疫。然后在加强免疫后3天处死小鼠,无菌取脾,获得的脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞或者NS-1细胞通过化学试剂聚乙二醇(PEG)诱导融合。本研究中总共进行了4次细胞融合,经筛选和亚克隆,最后获得叁株阳性杂交瘤细胞,分别为2D7、4D4和5D12。经Mouse单抗亚型鉴定试剂盒鉴定抗体亚型全为IgM型,轻链为Kappa。通过体内诱生的方法产生大量单克隆抗体,经测定,2D7、4D4、5D12腹水效价分别为1:3200、1:51200和1:12800。利用优球蛋白纯化法得到初纯抗体。最后,我们鉴定了抗体的特异性和交叉反应性。ELISA检测结果显示,叁种单克隆抗体均与牛胰岛素发生交叉反应。Western blot实验结果提示,叁种抗体可能识别胰岛素的构象性表位,而非线性表位。3.抗胰岛素多克隆抗体的制备。我们用商品化的猪胰岛素和牛胰岛素分别作为抗原,采用背部多点注射和腹腔注射的方式免疫豚鼠。一共免疫4次,最后免疫5天后,采用心脏取血的方法收集大量血清。利用间接ELISA方法测定血清效价,抗原为猪胰岛素的豚鼠血清效价为1:25600,抗原为牛胰岛素的豚鼠血清最高效价为1:51200。经饱和硫酸铵沉淀后,成功获得粗纯的多克隆抗体。随后我们鉴定了抗体的特异性和交叉反应性。ELISA检测结果显示,抗猪胰岛素多克隆抗体能与牛胰岛素发生交叉反应,且抗牛胰岛素多克隆抗体与猪胰岛素也能发生交叉反应。Western blot实验结果显示,两种多克隆抗体均能与猪胰岛素和牛胰岛素特异性结合。综上所述,我们成功地获得了3株分泌抗胰岛素单克隆抗体的杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体,同时也成功地制备出抗胰岛素多克隆抗体,并对抗体特性进行了初步研究,为实验室自行建立胰岛素水平的检测方法提供基础。
张波[8]2002年在《压电石英晶体凝血分析及微阵列免疫传感器的实验研究》文中研究说明目的： 建立压电石英晶体振荡频率检测平台，探讨压电石英晶体传感器液相检测的影响因素，以此构建压电石英晶体凝血分析传感器和压电石英晶体微阵列免疫传感器，并探索临床应用的可行性。 方法： 1．利用微细加工技术制作石英晶体基片，在其表面蒸镀金膜电极，比较不同电极厚度及直径对凝血分析和免疫传感器检测的影响。在粘胶式2×5型微阵列传感器基础上建立夹具式2×5型微阵列传感器。自行设计制作自激式TTL振荡电路、优化PESA V2.0版频率记录分析软件。并将它们与温控、防震、屏蔽装置及计算机有机集成，以构建压电石英晶体微阵列传感器振荡频率通用检测平台。 2．探讨压电石英晶体传感器液相检测过程中，反应体系密度、粘度、离子浓度、pH、体积、温度以及重复加样、机械冲击等对晶体振荡频率的影响，以确定压电石英晶体生物传感器合适的检测体系和条件，减少或消除非特异性生物反应的干扰。 3．以血浆凝集反应过程为基础，观察压电石英晶体振荡频率在血浆凝集反应过程中的变化规律，建立血浆凝集反应起点和终点的判断标准，构建压电石英晶体传感器检测血浆凝血酶原时间(PT)、血浆凝血酶时间(TT)、血浆部分活化凝血酶时间(APTT)的方法。进行临床标本检测，并与STAGO磁珠法进行对比分析，探讨压电石英晶体凝血分析传感器用于临床检测的可行性。 4．分别用Sulfo-LC-SPDP巯基化固定法和蛋白A法将抗人胰岛素抗体固定在压电石英晶体免疫传感器金膜表面，比较抗体固定量及一致性、抗压电石英晶体凝血分析及微阵列免疫传感器的实验研究体膜的生物反应活性以及构建的压电石英晶体胰岛素免疫传感器的响应特性和重复再生能力，寻找压电石英晶体免疫传感器抗体固定的最佳方法。 5.以2 xs型夹具式微阵列传感器为基础，设计并构建压电石英晶体AFP一CEA一PSA一hCG肿瘤标志物微阵列免疫传感器，具体确定传感器的检测时间、温度等条件，建立传感器检测标准曲线，观察检测灵敏度、线性检测范围、非特异响应特性、再生重复使用能力。进行临床标本检测并与传统标记免疫分析方法对比，探讨检测临床标本的可行性。 6.建立压电石英晶体胰岛素一C肤微阵列免疫传感器，观察传感器的响应特性，并进行临床标本检测，探讨质量效应型压电石英晶体免疫传感器检测小分子量生物分子的可行性。 结果: 1.AT切型、基频IOMHz，金膜电极直径4.Ollun，电极厚度在IO0nm一150nm范围的石英晶体插损较小、液相起振能力强、频率稳定、灵敏度高、质量负载能力大，最适合压电凝血分析和抗原一抗体结合的检测。在粘胶式微阵列传感器基础上构建的夹具式微阵列传感器克服了因粘胶等方式导致传感器的应力分布不均的弊端，频率稳定度液相蕊士ZHz/h，成功实现了传感器在液相中的稳定振荡。 2.自行搭建的压电石英晶体微阵列传感器振荡频率通用检测平台采用自激式TTL振荡检测电路，在液相中起振能力强大，其频率稳定度达10，Hz，不加任何稳频、稳幅措施，真实地反映了压电石英晶体传感器振荡频率的变化，完全满足压电石英晶体生物传感器的实用要求。功能优化后的PESAV2.0版频率记录分析软件，具有自行设置各初始参数，实时记录频率变化、自动绘制频率变化趋势图及结果分析等多项功能，采集的数据自动输入到计算机，智能化程度较高。并辅以温控、防震、屏蔽装置，减少和消除了外界因素的干扰。把上述各部分有机整合成的压电石英晶体微阵列传感器振荡频率检测平台具有小型、美观、智能、实用的特点。 3.压电石英晶体传感器液相检测时，反应体系密度、粘度、离子浓度、PH对晶体振荡频率有影响，石英晶体振荡频率随溶液上述参量的增大而降 X第叁军医大学博士学位论文低，以密度和粘度的影响最大;温度、机械冲击、重复加样不影响或暂时影响石英晶体振荡频率，经短时间平衡后，石英晶体振荡频率会恢复到原振荡频率值附近。 4.在血浆凝集反应过程中，石英晶体振荡频率随凝集反应的进行，反应体系密度和粘度迅速增大，而呈阶梯状快速下降;在凝集反应终点附近，出现晶体频率快速上升转而逐渐降低直至稳定的特征性变化。石英晶体频率阶梯状快速下降的起点为血浆凝集反应的起点，在终点附近频率出现快速升高到下降的转折点为凝集反应的终点，起点和终点之间的时间即为血浆凝集反应时间。改变血浆凝集反应的条件，就可分别检测血浆PT、TT和APTT。压电石英晶体凝血分析传感器检测结果与万别卯法作线性回归分析，相关系数r分别为0.959、0.964、0.972，两种方法结果符合程度高。 5.Sulfo一LC一SPDP琉基化法和SPA法的操作难易程度及制备的压电石英晶体胰岛素免疫传感器的检测灵敏度、检测时间相当。但Sulfo一LC一SPDP琉基化固定抗体膜的量、一致性和生物反应活性以及制作的压电石英晶体免疫传感器的响应能力、检测重复性、检测线性范围、非特异响应特性、重复再生使用次数等均比S队法
谭明乾[9]2005年在《新型稀土荧光探针及时间分辨荧光生化分析法研究》文中研究指明基于稀土荧光探针长寿命荧光特性而发展起来的高灵敏度时间分辨荧光生化分析技术已经在临床检测与生物技术领域得到了广泛的应用。在本学位论文的研究中,设计、制备和表征了数种新型的稀土荧光配合物和纳米稀土荧光微粒,建立了几种以新合成的稀土荧光配合物和纳米荧光微粒为探针的高灵敏度时间分辨荧光生化分析新方法。设计并合成了一种新型有机配位体-4’-(2”’-噻吩基)-2,2’:6’,2”-联叁吡啶-6,6”-二甲胺四乙酸(TTTA),TTTA-Eu3+的荧光量子收率可达0.15,荧光寿命1.284 ms,探讨了影响铕、铽与TTTA配合物发光的规律。利用TTTA-Eu~(3+)为荧光探针标记链亲合素(SA),对人血清中前列腺特异抗原(PSA)和胰岛素(insulin)的时间分辨荧光免疫测定表明,该方法最低检测下限分别为33 pg·ml~(-1)和44 pg·ml~(-1),具有较高的精密度和准确度。利用反相微乳液法制备了表面带有活性氨基的硅胶包裹TTTA-Eu~(3+)型和共价键合4,4’-二(1”,1”,1”,2”,2”,3”,3”-七氟-4”,6”-己二酮-6”-基)氯磺酰基-邻二苯基苯(BHHCT)-Eu~(3+)型纳米荧光微粒。所制备的铕荧光纳米粒子形状规则,尺寸均匀,抗光漂白性能远优于铕配合物。其中共价键合型纳米粒子的荧光量子产率可达50%。将SA标记到纳米粒子上后,探讨了其在时间分辨荧光免疫测定人血清中甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和乙肝表面抗原(HBsAg)中的应用,最低检出浓度分别为85pg·ml~(-1)、1.9pg·ml~(-1) 和23pg·ml~(-1),显示了较高的灵敏度、精密度和准确度,与已有的分析方法也具有很好的相关性,表明新方法具有很好的应用前景。 采用溶胶-凝胶技术,制备出了一种共价键合BHHCT-Eu~(3+)的有机-无机杂化二氧化钛荧光纳米粒子,系统地研究了溶剂种类和EuCl_3 浓度对荧光微粒的粒径和荧光寿命的影响。所制备的荧光纳米微粒的荧光量子产率达11.6%,荧光寿命在0.4 ms左右。这种纳米粒子也被成功地用于时间分辨荧光免疫测定。设计、合成和表征了一种新型铽荧光配合物单线态氧特异性荧光探针-N,N,N~1,N~1-[2,6-二(3’-胺甲基-1’-吡唑基)-4-(9’-蒽基)吡啶]四乙酸(PATA)-Tb~(3+),其与单线态氧反应生成内氧化物后,荧光量子产率增加20多倍,荧光寿命达2.76ms,用MoO_4(2-)/H_2O_2体系作为单线态氧源的最低检测限达10.8 nmol·L~(-1),表明其可用于单线态氧的高灵敏度检测。
罗勇[10]2006年在《胰岛素口腔喷雾给药体系中几个问题的研究》文中认为糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)是现代社会人类健康的主要威胁之一。据估计,在我国糖尿病患者已超过2000万,而且呈逐年上升的趋势。国际糖尿病联合会(IDF)的资料显示,全球有约2亿人患糖尿病,到2025年可能超过3亿人。而胰岛素是治疗糖尿病的主要药物,给药方式以注射为主。长期注射给药给糖尿病患者带来了诸多痛苦和不便,因此非注射给药的胰岛素制剂是目前国内外新药开发的热点。华中科技大学生物无机研究室历时十年,研发了一种有效的重组人胰岛素口腔喷雾给药体系(IES),本文正是在此基础上,对IES中重组人胰岛素(下称胰岛素)定量、胰岛素与功能分子间的弱相互作用以及IES的微观结构等方面进行了较为深入的研究,主要内容如下:①卵磷脂和苯酚会极大地干扰IES中胰岛素的HPLC-UV测定,因此我们采用ESI-MS技术筛选一种能除去IES中大量卵磷脂和苯酚的萃取剂,发现正戊醇能够满足对胰岛素定量的要求,在优化的色谱条件下得到了很好的测定结果。其中测定胰岛素的线性关系良好,线性范围是1.05~7.34U/mL,相关系数0.99936,回收率为98.1 ~102.5%,日间精密度RSD:0.5%(n=6);检出限(LOD)和检出量(LOQ)分别为0.01U/mL,0.03 U/mL。通过上述测定方法,我们初步研究了IES的储存条件和有效期,结果显示在4℃避光条件下IES可以稳定存放一年。另外,IES长时间存放的物理化学性质实验结果亦表明,在一年内IES的粒径、pH值、分散度、粘度以及折光率改变不大,完全能够保持IES的基本性状。②通过ESI-MS实验证实了在溶液中作为IES抑菌剂的苯酚可以与胰岛素形成较为稳定的非共价复合物,按照化学计量数的比例推测在溶液中胰岛素二聚体、叁聚体、四聚体以及六聚体都能与苯酚形成稳定的非共价复合物。实验中我们还发现苯酚可以增敏胰岛素的ESI-MS检测灵敏度,这种增敏效应在不同的溶液浓度与酸度条件下都能随着苯酚的加入量的增加而增强,当溶液中苯酚与胰岛素的摩尔比超过1000:1(phenol:insulin)时,有明显的增敏作用,当这个比例达到5000:1时,增敏作用达到最大,并且这种增敏作用对带电荷数多的胰岛素离子峰的增敏效应更强。根据上述实验现象,我们推测了可能的“质子转运机理”来解释苯酚的增敏效应。通过ESI-MS实验还检测到酪氨酸能与胰岛素以摩尔比为1:1的比例形成较为稳定的复合物,这种非共价复合物的确证对于某些生命过程的了解或许有一定的参考作用。采用了CD与IR光谱技术对胰岛素的二级结构进行了较为系统的研究,发现胰岛素溶液的酸度与浓度对胰岛素的二级结构影响都很大,并能影响胰岛素的聚集行为。苯酚以及某些酚类化合物对胰岛素二级结构的影响也很大,它们都可能成为胰岛素的变构剂,这在一定程度上也印证了ESI-MS的实验结果。③通过电导率和透光率滴定的方法绘制IES的近似体系-卵磷脂/丙二醇/PBS的伪叁元的相图,并以同样的方法得到了加药(胰岛素)体系的相图,这两个相图的主要区别在于加药体系的W/O和O/W区域都有所缩小。在加药体系的相图中,IES处在O/W区域,属于O/W型乳液,这也证明了在IES中作为透膜促进剂而大量使用的卵磷脂,从乳液组成上来看还起到了一般微乳体系中油相的作用,卵磷脂不但可以更好地促进胰岛素透膜,而且保持稳定的乳液性状,另外也为IES的微观结构的研究奠定基础。激光粒度仪和透射电镜的实验表明IES体系中的微粒分布均匀,粒径分布为较窄的单分布,粒径分布在20nm到260nm的范围内,90%的粒径小于115nm,平均粒径为67.5nm,因此可将IES归为微乳给药体系。ESI-MS、CD光谱、31P-NMR和TIRFM荧光成像4种实验方法确认胰岛素与卵磷脂之间存在非共价键合的弱相互作用,胰岛素可以分布在水相和IES微粒的表面和中心,HPLC的测定实验说明与这些微粒结合的胰岛素分子超过叁成。最后,根据以上实验结论推测出了IES的可能的微观结构,在IES中的微粒主要由卵磷脂形成,存在4种主要形式,即半封闭的囊泡(SCV)、大尺寸的单室囊泡(LUV)、多层囊泡(MLV)和多室囊泡(MVV)。这为进一步研究胰岛素的透膜机制,不断提高胰岛素的生物利用度提供了有价值的参考。④采用FITC标记胰岛素荧光成像的方法初步研究了HepG2细胞和大鼠大脑皮层神经元细胞膜上的胰岛素受体(IR)与胰岛素的结合以及结合后去向,胰岛素瞬间与细胞膜上的胰岛素受体结合,而后通过细胞内化进入胞内。实验还证实了在神经元的胞体和突起(包括轴突和树突)都分布着胰岛素的受体,这些受体对于胰岛素完成脑内功能作用重大。通过FITC标记胰岛素荧光成像方法还证实了IES体系中大豆磷脂确有促进胰岛素透粘膜的作用,在无促进剂时,胰岛素很难透过大鼠舌下粘膜层,而在大豆磷脂的作用下,胰岛素在60min内可以透过舌下粘膜层进入血液循环。实验表明这种简单、直观的成像方法可以成为筛选胰岛素(或其它多肽类药物)透膜(或透皮)的吸收促进剂的方法之一,为快速、定性地判断某种促进剂(或制剂)是否有透膜的能力提供了一种较为简便、可靠的方法。
参考文献：
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[5]. C肽化学发光免疫诊断分析方法的建立及临床应用[J]. 钮心怡, 路晟, 孙旭东, 江振友. 中国卫生检验杂志. 2007
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[8]. 压电石英晶体凝血分析及微阵列免疫传感器的实验研究[D]. 张波. 第叁军医大学. 2002
[9]. 新型稀土荧光探针及时间分辨荧光生化分析法研究[D]. 谭明乾. 中国科学院研究生院（大连化学物理研究所）. 2005
[10]. 胰岛素口腔喷雾给药体系中几个问题的研究[D]. 罗勇. 华中科技大学. 2006
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