论文摘要
克隆甜菜夜蛾（Spodoptera exigua,H（u|¨）bner）的谷氧还蛋白（glutaredoxin,Grx）基因,构建甜菜夜蛾的谷氧还蛋白原核蛋白表达系统,最终得到高纯度的谷氧还蛋白,并测定SeGrx1的酶动力学参数。RACE技术克隆甜菜夜蛾SeGrx1基因全长,构建pET16b-SeGrx1原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍柱初步纯化裂解菌液上清可溶性蛋白,Tev酶切除融合蛋白的6x His标签,再用Superdex75/200分子筛进一步纯化,目的蛋白的Western-bloting （WB）验证,酶动力学参数测定。SeGrx1基因的GeneBank的注册号MK318813,构建了表达效率很高的pET16b-SeGrx1重组质粒,最佳诱导方式:在细菌生长至OD600=0.6时加入终浓度0.5mM的IPTG,30℃诱导4h;最佳纯化方式为:先用镍柱纯化菌液上清中可溶性蛋白,20mM,50mM咪唑梯度洗脱杂蛋白,300mM咪唑洗脱融合蛋白;最佳酶切融合蛋白的条件为:在含有0.5mM EDTA和1mM DTT的酶切缓冲液中,去除融合蛋白中的高浓度盐和咪唑,在pro:tev=2:5时（质量比）可以得好的酶切效果;再用Superdex 75/200分子筛进一步纯化,可获得纯度在95%以上目的蛋白。WB验证我们所表达的蛋白就是SeGrx1,以谷胱甘肽还原酶作为反应底物测定酶的活性为3.1倍hGrx1活性,酶学动力学参数Vmax=13.87 （±0.083）,Km=6.5 （±0.17）×10～（-3）。成功在体外大量表达高纯度高活性的甜菜夜蛾谷氧还蛋白Grx1,并且获得了它的酶学动力学参数,将为进一步挖掘谷氧还蛋白的生物学功能,为探索以谷氧还蛋白作为特异性杀虫剂靶标打下了基础。
论文目录
文章来源
类型: 国内会议
作者: 杨付来,王月华,赵真真,张兰,张燕宁,毛连刚,蒋红云
关键词: 甜菜夜蛾,谷氧还蛋白,技术,原核表达,蛋白纯化,酶动力学参数
来源: 中国植物保护学会2019年学术年会 2019-10-23
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 中国农业科学院植物保护研究所农业部有害生物综合治理重点实验室
分类号: Q78
页码: 152
总页数: 1
文件大小: 41k
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