真菌黑曲霉（Aspergillus niger）对U（Ⅵ）的吸附富集与机理研究

论文摘要

黑曲霉（A.niger）作为工业高产酶系菌株,在发酵行业被广泛研究,由于其对外界胁迫具有较强耐受特性,能够在放射性核素及伴生重金属污染的生物修复过程中表现出一定优势。本研究选取模式菌株A.niger为研究对象,针对尾矿周边污染物中存在的放射性污染六价铀U（Ⅵ）为胁迫介质,通过对U（Ⅵ）胁迫培养下A.niger的生理生化指标受影响的程度的研究,全面分析在U（Ⅵ）胁迫过程中A.niger细胞损伤效应及其耐受程度和潜在的应对胁迫的细胞内部抗胁迫响应机制。此外,通过对活性及非活性A.niger菌球对U（Ⅵ）的吸附富集过程进行微观分析,进而详细的探索微生物与放射性核素结合的潜在吸附富集特性及微观吸附机理。在此研究结果的基础上,对A.niger生物质材料进行改性研究,进一步验证其潜在的放射性污染废水的生物净化和实际应用潜力。研究结果如下:（1）耐受真菌A.niger在实验设定的不同初始U（Ⅵ）浓度暴露胁迫下发现其在100-125 mg/L时,菌球的生长、袍子的萌发才开始出现较为明显的抑制,说明A.niger对核素U（Ⅵ）表现出一定的抗性。通过对初始U（Ⅵ）浓度、介质温度、pH及投料量进行吸附富集实验的研究结果表明,当环境介质温度维持在30℃、pH=5、0.04g投料量时能够维持A.niger的最佳吸附状态,达到39.38 mg/g。通过长期暴露在U（Ⅵ）胁迫环境中的实验结果表明,A.niger细胞逐渐通过生长代谢和协同细胞内部的潜在解毒抗性机制,能够降低表面富集和向内部转移的U（Ⅵ）所造成的毒性影响。在额外添加草酸的研究中发现,草酸可以络合重金属离子形成草酸盐络合物并降低金属离子的毒性,通过对比两种培养基培养三天内Aniger细胞内外富集情况的研究结果发现,额外添加草酸的总富集量和细胞外富集量较对照组相比呈现增加趋势,而转移至细胞内的U（Ⅵ）出现降低趋势,说明外源草酸可以促进A.niger对U（Ⅵ）的富集,同时又能降低环境介质中U（Ⅵ）的活度与转移性,达到降低U（Ⅵ）毒性胁迫的作用。通过对液体发酵胁迫培养情况下A.niger细胞内降解酶酶活的检测发现,长期暴露在存在U（Ⅵ）胁迫的发酵体系中的A.niger维素降解酶系受影响程度表现为:在实验设定的最高浓度（125 mg/L）下,羧甲基纤维素酶活（CMCA）较对照组下降18.86%,滤纸酶活（FPA）下降28.32%。而受应激反应造成A.niger细胞内木质素降解酶系的影响较为明显,LiP和MnP酶活较对照组相比分别下降25.57%和42.06%。由此也反映出细胞内部的损伤程度较为明显。（2）通过对A.niger长期暴露在U（Ⅵ）胁迫情况下细胞内氧化损伤效应及其内部抗氧化机制受影响程度进行研究分析。结果表明A.niger细胞长期暴露在U（Ⅵ）胁迫介质中,其细胞内部由于核素毒性的积累,产生应激反应造成氧自由基物质（O2·-、·HO、H2O2）的显著增加,最终通过细胞内较高浓度的MDA含量反应其质膜的氧化损伤程度。结合抗氧化系统中主要的SOD和CAT酶活活性的进一步研究发现,随着介质中U（Ⅵ）浓度的上升,两种抗氧化酶活性也随之显著增加,而在受胁迫的第三天后开始出现损伤程度的缓解,说明A.niger通过细胞代谢调节和抗氧化机制开始产生对U（Ⅵ）的抗性,这一结果也与其细胞内部GSH-Px的含量增加相吻合,GSH-Px开始逐渐缓解核素U（Ⅵ）对细胞产生的氧化损伤。暴露在U（Ⅵ）胁迫下A.niger细胞损伤主要原因是U（Ⅵ）的过量积累影响菌体生长代谢,诱导其产生氧自由基并引起毒性产生,通过对R（SOD/CAT）与细胞内H2O2含量的相关性分析发现,A.niger细胞内部的应激反应触发SOD酶活活性的增加,同时,自由基的清除过程造成过量的CAT酶消耗,破坏了生长初期的CAT酶活供给平衡,最终导致细胞内H2O2的积累,引起质膜的氧化损伤。（3）通过对活性及非活性A.niger菌球吸附剂对U（Ⅵ）的吸附富集实验进行对比研究。实验结果表明,非活性A.niger菌球吸附剂由于失去活性,不再受到影响吸附因素如温度、pH、高浓度U（Ⅵ）毒性影响,表现出较活性菌球的相比更高效的去除能力。在最佳的吸附环境下（30℃、pH=5）,非活性菌球的吸附能力为83.40 mg/g,远高于活性菌球50.65 mg/g。通过对吸附模型的研究实验发现,两种菌球的U（Ⅵ）吸附过程能够很好的采用Langmuir等温模型和伪二阶动力学模型进行拟合分析,并且结合热力学模型能够将两种菌球对核素U（Ⅵ）的吸附特性总结为三个过程:溶液中游离的U（Ⅵ）首先与菌球表面大量的羟基、氨基、羧基等吸附位点进行单层覆盖点对点的快速吸附;通过消耗能量的生物传质过程将U（Ⅵ）扩散至紧密缠绕的菌丝球内部直至所有吸附位点被完全占据。此外,结合现代的分析手段（SEM、EDX、FT-IR、XPS）对核素U（Ⅵ）吸附机理进行深入研究分析。结果发现A.niger菌丝体表面富含大量的活性羟基、氨基、羧基官能团,能够与羟基化的核素发生络合,从而固定吸附介质中的目标污染物达到吸附富集的效果。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第一章绪论

1.1 引言

1.2 放射性核素污染的影响及处理

1.2.1 放射性核素污染对环境及生物的危害

1.2.2 放射性核素污染的治理

1.2.3 放射性核素的生物修复

1.3 微生物吸附过程的作用机制

1.3.1 生物吸附剂类型

1.3.2 微生物吸附特性

1.3.3 微生物吸附机理

1.4 微生物与金属离子交互作用的研究进展

1.4.1 金属离子对微生物的毒性效应研究

1.4.2 金属离子对微生物的毒性影响研究

1.4.3 微生物对金属离子抗性效应研究

1.5 生物吸附模型研究

1.5.1 吸附等温模型

1.5.2 吸附热力学模型

1.5.3 吸附动力学模型

1.6 课题来源及研究目的与意义

1.6.1 课题来源

1.6.2 研究目的及意义

1.7 主要研究内容及创新点

1.7.1 研究内容

1.7.2 研究创新点

第二章 U（Ⅵ）胁迫状态下A.niger生理生化影响研究

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验试剂、培养基、材料与实验设备及仪器

2.2.1.1 实验用主要化学试剂

2.2.1.2 实验用培养基及储备液

2.2.1.3 实验用菌株

2.2.1.4 主要实验仪器

2.2.2 实验方法

2.2.2.1 A.niger活化及孢子悬浮液的制备

2.2.2.2 A.niger菌球的准备

2.2.2.3 A.niger细胞提取液的制备

2.2.2.4 A.niger在核素胁迫状态下的生长状况及耐受程度的研究

2.2.2.5 不同因素对A.niger吸附的影响

2.2.2.6 A.niger细胞内部对核素的富集实验

2.2.2.7 核素胁迫状态下纤维素降解酶活性的影响

2.2.2.8 核素胁迫状态下木质素降解酶活性的影响

2.2.3 表征方法

2.2.3.1 冷场发射扫描电镜-能谱分析（SEM-EDX）

2.2.4 实验数据与分析

2.3 结果与分析

2.3.1 核素U（Ⅵ）胁迫下A.niger生长代谢影响

2.3.1.1 不同初始U（Ⅵ）浓度胁迫下A.niger生长状况

2.3.1.2 不同初始U（Ⅵ）浓度胁迫下A.niger孢子萌发及生长曲线

2.3.1.3 不同初始U（Ⅵ）浓度胁迫下A.niger生物量抑制情况

2.3.2 核素U（Ⅵ）胁迫下A.niger吸附富集特性

2.3.2.1 吸附环境温度对吸附过程的影响

2.3.2.2 吸附环境pH对吸附过程的影响

2.3.2.3 菌球形成的转速对吸附过程的影响

2.3.2.4 菌球投料量对吸附过程的影响

2.3.2.5 不同U（Ⅵ）初始浓度对吸附的影响

2.3.2.6 吸附时间对吸附过程的影响

2.3.2.7 生长过程中的A.niger细胞富集特性

2.3.3 核素U（Ⅵ）胁迫下A.niger降解酶系酶活活性

2.3.3.1 不同初始U（Ⅵ）浓度胁迫下A.niger羧甲基纤维素酶活性

2.3.3.2 不同初始U（Ⅵ）浓度胁迫下A.niger滤纸酶活活性

2.3.3.3 不同初始U（Ⅵ）浓度胁迫下A.niger木质素过氧化物酶活性

2.3.3.4 不同初始U（Ⅵ）浓度胁迫下A.niger锰过氧化物酶活性

2.3.4 核素U（Ⅵ）胁迫A.niger菌丝体形貌影响

2.3.4.1 A.niger富集U（Ⅵ）前后形貌及菌体形态影响

2.3.4.2 A.niger富集U（Ⅵ） EDX分析

2.4 讨论

2.5 本章小结

第三章 U（Ⅵ）胁迫状态下A.niger细胞氧化损伤及酶促抗氧化系统研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 主要实验试剂

3.2.2 主要实验仪器

3.2.3 分析方法

3.2.3.1 核素U（Ⅵ）胁迫状态下细胞氧化损伤状况的影响

3.2.3.2 核素U（Ⅵ）胁迫状态下细胞内抗氧化酶活性的影响

3.3 结果与分析

3.3.1 核素U（Ⅵ）胁迫下A.niger细胞氧化损伤分析

3.3.1.1 不同初始U（Ⅵ）浓度胁迫下A.niger细胞总抗氧化能力分析

3.3.1.2 U（Ⅵ）暴露胁迫下A.niger细胞活性氧（ROS）清除能力

3.3.1.3 不同初始U（Ⅵ）浓度胁迫下A.niger细胞氧化损伤效应（MDA）分析

3.3.2 核素U（Ⅵ）胁迫下A.niger细胞抗氧化系统分析

3.3.2.1 不同初始U（Ⅵ）浓度胁迫下A.niger细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性分析

3.3.2.2 不同初始U（Ⅵ）浓度胁迫下A.niger细胞过氧化氢酶（CAT）活性分析

3.3.2.3 不同初始U（Ⅵ）浓度胁迫下A.niger细胞谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性分析

3.3.2.4 核素U（Ⅵ）胁迫状态下A.niger细胞内SOD与CAT的协同作用分析

3.4 讨论

3.5 本章小结

第四章活性与非活性A.niger对U（Ⅵ）吸附特性与机理研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 生物吸附剂材料制备

4.2.1.1 活性与非活性A.niger菌球吸附剂的制备

4.2.2 经验模型分析

4.2.2.1 吸附等温线研究

4.2.2.2 吸附热力学研究

4.2.2.3 吸附动力学研究

4.2.3 表征方法

4.2.3.1 冷场发射扫描电镜-能谱分析（SEM-EDX）

4.2.3.2 博里叶红外光谱分析（FT-IR）

4.2.3.3 X射线光电子能谱（XPS）

4.2.3.4 Zeta电位分析

4.2.4 实验数据与分析

4.3 结果与分析

4.3.1 活性与非活性A.niger生物吸附材料的表征分析

4.3.1.1 活性与非活性A.niger菌球表面形貌分析

4.3.1.2 暴露在U（Ⅵ）状态下活性与非活性A.niger菌丝体表征分析

4.3.1.3 暴露在U（Ⅵ）状态下活性与非活性A.niger菌丝体表面元素分析

4.3.2 活性与非活性A.niger菌球吸附剂对核素U（Ⅵ）的吸附特性研究

4.3.2.1 pH值对吸附的影响

4.3.2.2 生物吸附剂吸附效率及再生性能研究

4.3.2.3 活性与非活性A.niger菌球对U（Ⅵ）吸附的等温模型研究

4.3.2.4 活性与非活性A.niger菌球对U（Ⅵ）吸附的热力学研究

4.3.2.5 活性与非活性A.niger菌球对U（Ⅵ）吸附的动力学模型研究

4.3.3 活性与非活性A.niger菌球吸附剂对核素U（Ⅵ）的吸附微观机理研究

4.3.3.1 FT-IR分析

4.3.3.2 吸附机理分析

4.4 讨论

4.5 本章小结

研究结论与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 丁翰林

导师: 罗学刚

关键词: 黑曲霉,氧化应激,生物积累,抗氧化酶,抗氧化反应,解毒机制,木质素分解酶,吸附机理

来源: 西南科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,矿业工程,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 西南科技大学

基金: 西南科技大学罗学刚教授主持的国家国防基础科研项目(16ZG6101)

分类号: X753;X172

DOI: 10.27415/d.cnki.gxngc.2019.000001

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