重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗研究及应用

论文摘要

H5和H7亚型高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV）通常可导致感染家禽全部死亡,引起疫情的暴发。2003年以来,在全球60多个国家和地区暴发了H5亚型AI疫情。同时,H5和H7亚型AIV均能导致人发病和死亡,给人类健康带来严重威胁。疫苗免疫是适合我国国情的AI最有效防控措施之一。2014年以来,我国家禽中分离的H5亚型AIV主要属于2.3.4.4分支,国家禽流感参考实验室研制的H5N1亚型Re-8株系列灭活疫苗,已在家禽中广泛应用并取得了良好的效果。2017年初,我国人H7N9流感疫情增多,家禽中出现H7N9亚型HPAI疫情,迫切需要能够同时预防H5和H7亚型AI的禽AI疫苗。本研究首先对H7N9 H7-Re1疫苗株的病毒含量、毒力、免疫原性等生物学特性进行了系统鉴定。结果显示,该疫苗种毒生物安全度高、特异性强、免疫原性好且能在鸡胚中高效稳定增殖,是用于H7亚型HPAI防控的理想疫苗种毒。其次,以H5N1 Re-8株和H7N9 H7-Re1株疫苗种毒为基础,研制出重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）（以下简称H5+H7二价灭活疫苗）,进行了安全性和有效性的系统评估。将H5N1 Re-8株和H7N9 H7-Re1株鸡胚尿囊液分别2倍浓缩,使用甲醛灭活后,按照本研究确定的1:1.5抗原比例乳化制备成H5+H7二价灭活疫苗。安全性试验结果表明,大剂量、单剂量和单剂量重复接种的SPF鸡在接种后14日内,无任何不良反应。该疫苗最小免疫剂量为0.1mL,免疫后3w H5和H7亚型HI抗体平均滴度均在6log2以上;肌肉与颈部皮下途径免疫SPF鸡,效力无明显差异,均可产生较高的抗体水平,高峰期（首免后4w）抗体水平即可达9log2,SPF鸡肌肉注射免疫后14d到210d均可获得完全保护;抗体与攻毒保护结果表明,免疫后3w H5和H7亚型HI抗体滴度达到3log2时可以获得抗死亡保护,达到4log2及以上时可获得完全保护。最后,将H5+H7二价灭活疫苗免疫商品蛋鸡、商品白羽肉鸡、商品黄羽肉鸡、商品鹅以及商品肉鸭,进行田间试验。结果表明,该疫苗具有良好的安全性,免疫不同品种的家禽后均吸收良好,无局部或全身不良反应。该疫苗免疫蛋鸡后HI抗体可高达9log2左右（免疫后150d）,免疫持续期达150d,按程序免疫后,抗体更高,持续期更长;商品白羽肉鸡经一次免疫、商品黄羽肉鸡和商品肉鸭经二次免疫,上市前均能获得完全免疫保护。商品蛋鸭和种鹅按程序免疫,免疫后能产生良好的抗体,均可以抵御H5和H7亚型AI高致病性禽流感病毒的攻击。本研究研制出H5+H7二价灭活疫苗,对鸡、鸭和鹅均具有良好的安全性和有效性。2017年9月,该疫苗开始在全国家禽中应用,已在预防家禽H5和H7亚型AI及成功阻断人感染H7N9病毒过程中发挥重要作用。

论文目录

摘要

abstract

英文缩略表

第一章引言

1.1 禽流感病毒概述

1.2 高致病性禽流感在家禽中的危害

1.2.1 H5 亚型禽流感在家禽中的危害

1.2.2 H7 亚型禽流感在家禽中的危害

1.3 高致病性禽流感对人的危害

1.4 高致病性禽流感的疫苗研究进展

1.4.1 重组病毒活载体疫苗

1.4.2 DNA疫苗

1.4.3 全病毒灭活疫苗

1.5 本研究的目的和意义

第二章 H7-Re1 株疫苗种毒的生物学特性研究

2.1 材料

2.1.1 病毒

2.1.2 试验鸡和鸡胚

2.1.3 血清

2.1.4 主要试剂和仪器

2.2 方法

50)的测定'> 2.2.1 鸡半数致死量(LD₅₀)的测定

2.2.2 种毒的传代

2.2.3 病毒含量的测定

50)'> 2.2.3.1 鸡胚半数感染量测定(EID₅₀)

2.2.3.2 红细胞凝集价的测定

2.2.4 鸡胚毒力鉴定

2.2.5 雏鸡毒力鉴定

2.2.6 种毒的序列测定

2.2.7 特异性测定

2.2.8 纯净性检验

2.2.8.1 无菌检验

2.2.8.2 支原体检验

2.2.8.3 鸡胚法外源病毒检验

2.2.8.4 细胞法外源病毒检验

2.2.9 免疫原性试验

2.2.9.1 疫苗的制备

2.2.9.2 免疫

2.2.9.3 抗体测定

2.2.9.4 攻毒试验

2.3 结果

50)测定结果'> 2.3.1 鸡半数致死量(LD₅₀)测定结果

2.3.2 病毒含量的测定结果

50)'> 2.3.2.1 鸡胚半数感染量测定(EID₅₀)

2.3.2.2 红细胞凝集价的测定结果

2.3.3 鸡胚毒力鉴定结果

2.3.4 雏鸡毒力鉴定结果

2.3.5 序列测定结果

2.3.6 特异性测定结果

2.3.7 种毒的纯净性检验结果

2.3.8 种毒的免疫原性试验结果

2.3.8.1 抗体测定结果

2.3.8.2 攻毒试验

2.4 讨论

第三章重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗的安全性和有效性研究

3.1 材料

3.1.1 病毒株、抗原及血清

3.1.2 抗原及血清

3.1.3 试验动物和鸡胚

3.2 方法

3.2.1 抗原配比研究

3.2.2 安全性试验

3.2.2.1 不同途径一次单剂量接种不同日龄SPF鸡的安全性试验

3.2.2.2 单剂量重复接种的安全性试验

3.2.2.3 大剂量接种的安全性试验

3.2.3 免疫效力试验

3.2.3.1 免疫

3.2.3.2 抗体检测

3.2.3.3 攻毒试验

3.2.4 最小免疫剂量试验

3.2.5 HI抗体与攻毒保护关系试验

3.2.6 免疫程序试验

3.2.6.1 免疫

3.2.6.2 抗体测定

3.2.6.3 攻毒试验

3.2.7 免疫持续期试验

3.2.7.1 免疫

3.2.7.2 抗体测定

3.2.7.3 攻毒试验

3.2.8 统计学分析

3.3 结果

3.3.1 抗原配比研究结果

3.3.2 安全性试验结果

3.3.2.1 不同途径一次单剂量接种不同日龄SPF鸡的安全性试验结果

3.3.2.2 单剂量重复接种的安全性试验结果

3.3.2.3 大剂量接种的安全性试验结果

3.3.3 免疫效力试验结果

3.3.3.1 抗体检测结果

3.3.3.2 攻毒试验结果

3.3.4 最小免疫剂量试验结果

3.3.4.1 抗体检测结果

3.3.4.2 攻毒试验结果

3.3.5 HI抗体与攻毒保护关系试验结果

3.3.6 免疫程序试验结果

3.3.6.1 抗体测定结果

3.3.6.2 攻毒试验结果

3.3.7 免疫持续期试验结果

3.3.7.1 抗体测定结果

3.3.7.2 攻毒试验结果

3.4 讨论

第四章重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗的临床应用评估

4.1 材料

4.1.1 病毒株、抗原及血清

4.1.2 疫苗

4.1.3 试验用动物及鸡胚

4.2 方法

4.2.1 安全性试验

4.2.2 蛋鸡免疫效力试验

4.2.2.1 免疫

4.2.2.2 抗体检测

4.2.2.3 攻毒试验

4.2.3 白羽肉鸡免疫效力试验

4.2.3.1 免疫

4.2.3.2 抗体检测

4.2.3.3 攻毒试验

4.2.4 黄羽肉鸡免疫效力试验

4.2.4.1 免疫

4.2.4.2 抗体检测

4.2.4.3 攻毒试验

4.2.5 蛋鸭免疫效力试验

4.2.5.1 免疫

4.2.5.2 HI抗体效价检测

4.2.5.3 攻毒试验

4.2.6 肉鸭免疫效力试验

4.2.6.1 免疫

4.2.6.2 HI抗体效价检测

4.2.6.3 病毒分离

4.2.7 种鹅免疫效力试验

4.2.7.1 免疫

4.2.7.2 HI抗体效价检测

4.2.7.3 攻毒试验

4.3 结果

4.3.1 安全性试验结果

4.3.2 蛋鸡免疫效力试验结果

4.3.2.1 HI抗体效价检测结果

4.3.2.2 免疫后攻毒保护性试验

4.3.3 白羽肉鸡免疫效力试验结果

4.3.3.1 HI抗体效价检测结果

4.3.3.2 免疫后攻毒保护性试验

4.3.4 黄羽肉鸡免疫效力试验结果

4.3.4.1 HI抗体效价检测结果

4.3.4.2 免疫后攻毒保护性试验

4.3.5 蛋鸭免疫效力试验结果

4.3.5.1 HI抗体效价检测结果

4.3.5.2 免疫后攻毒保护性试验

4.3.6 肉鸭免疫效力试验结果

4.3.6.1 HI抗体效价检测结果

4.3.6.2 病毒分离结果

4.3.7 种鹅免疫效力试验结果

4.3.7.1 HI抗体效价检测结果

4.3.7.2 免疫后攻毒保护性试验

4.4 讨论

第五章全文结论

参考文献

致谢

作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吴姣姣

导师: 田国彬

关键词: 禽流感,二价疫苗,研制,评估

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: 国家重点研发计划(2016YFD0501602,2017YFD0500701-3),现代农业产业技术体系(CARS-41-G12),国际科技合作平台建设(2016YFE0203200)

分类号: S852.4

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