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腺相关病毒介导的体内睾丸组织基因特异性敲除系统的建立

2020-12-08阅读(792)

腺相关病毒介导的体内睾丸组织基因特异性敲除系统的建立

论文摘要

精子发生是指通过一系列有丝分裂和减数分裂从精原干细胞至产生单倍体圆形精子细胞,这些细胞又经历复杂的形态重塑,最终分化成成熟的精子的过程。在这个复杂的过程中,细胞受许许多多基因的精密调控,研究并解析这一精密的调控网络成为解开精子发生谜团的重要一步。然而,由于精子发生过程的高度复杂性以及对体内微环境的高度依赖性,使得到目前为止没有较好的培养系统能够在体外实现完整的精子发生过程。因此,探索新的精子发生研究方法是-个亟待解决的问题。本研究利用同源重组技术将CRISPR Cas9系统中sgRNA功能元件插入到AAV表达载体中,获得经改造的AAV-sgRNA载体；随后,将验证过的人源Weel2#sgRNA构建入该载体中并行病毒包装；继之感染稳定表达spCas9的Hela-spCas9细胞,检测证明该载体能稳定表达并能够进行基因敲除。进一步我们以在睾丸组织特异表达、精子发生过程中减数分裂期的功能基因Sycp3作为目的基因,验证上述系统的可行性。首先,筛选Sycp3的sgRNA靶点,构建入改造的AAV-sgRNA载体,行病毒包装；随后利用显微注射技术将病毒注射入睾丸组织特异表达spCas9蛋白质的小鼠睾丸曲细精管内,通过T7E1分析体内细胞的基因敲除效果，同时利用H&E染色、免疫荧光以及精子计数等表型检测方法观察敲除后精子发生表型的改变。结果发现，敲除sycp3后的睾丸组织相对于刚性对照的睾丸组织出现体积及休重变小、生殖细胞脱落以及成熟精子产生减少等明显的表型,其睾丸中大部分精子发生停滞。本研究成功建立了一套可用于在体内睾丸组织中进行特异性敲除目标基因的系统,为生殖体内功能研究提供一个新的快捷而有效的手段。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 实验方法和材料
  •   一 实验材料
  •     1. 实验所用动物
  •     2. 菌株
  •     3. 质粒载体
  •     4. 细菌用培养基
  •     5. 细胞系及其培养基
  •     6. 引物设计与合成
  •     7. 抗体
  •     8. 主要试剂
  •     9. 主要仪器设备
  •     10. 生物信息分析软件
  •   二 实验方法
  •     1. 生物信息学分析
  •     2. 基因克隆
  •     3. 质粒转化与质粒提取
  •     4. 重组克隆的筛选与鉴定
  •     5. 细胞培养及相关实验
  •     6. 细胞总DNA提取及测序
  •     7. 细胞总RNA提取、逆转录及实时定量PCR
  •     8. T7E1分析
  •     9. Western blot分析
  •     10. Northern blot分析
  •     11. 小鼠基因型鉴定
  •     12. 病毒包装及感染
  •     13. 显微注射
  •     14. HE
  •     15. 免疫荧光
  •     16. 精子计数
  •     17. 重力沉降分选小鼠六种不同生精细胞
  • 实验结果
  •   1. AAV载体构建
  •     1.1 AAV载体构建示意图
  •     1.2 AAV感染细胞并验证基因敲除效率
  •   2. 睾丸特异表达Cas9蛋白质小鼠的繁殖及鉴定
  •   3. Sycp3 sgRNA靶点筛选
  •   4. AAV体内显微注射及表型检测
  •     4.1 显微注射示意图
  •     4.2 T7E1错配酶分析体内基因组DNA编辑效果
  •     4.3 qPCR检测体内sycp3敲除后各期生精细胞的marker基因变化
  •     4.4 体内敲除对睾丸大小及体重的影响
  •     4.5 HE检测体内敲除后睾丸形态的改变
  •     4.6 免疫荧光检测精子发生的变化
  •     4.7 精子计数
  •   5. 其他课题
  •     5.1 重力沉降分离小鼠六个时期生精细胞
  •     5.2 lnc5及lnc20表达检测
  • 小结
  • 讨论
  • 参考文献
  • 综述
  •   参考文献
  • 附录
  • 在读期间论文发表论文情况
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 邹定峰

    导师: 王琳芳

    关键词: 精子发生,病毒包装,显微注射

    来源: 北京协和医学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 北京协和医学院

    分类号: Q78

    DOI: 10.27648/d.cnki.gzxhu.2019.000489

    总页数: 75

    文件大小: 4708K

    下载量: 50

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