茶氨酸的异源合成和活性分析

论文摘要

茶氨酸（Theanine）是一种不参与蛋白组成的游离氨基酸,具有降血压、提高免疫力、抑制兴奋、减轻体重、缓解精神压力、提高学习能力和记忆力等广泛的药用和保健价值。微生物异源表达合成目标产品具有周期短、规模化、成本低、产品天然等优势,是对直接分离提取和化工合成等传统生产途径的重要补充。本研究探究了利用工业模式微生物大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）和益生菌乳酸菌（lactic acid bacteria,L.lactis）表达γ-谷氨酰胺转肽酶（GGT）异源合成茶氨酸的可行性,以为茶氨酸的高效、规模和安全生产提供依据。主要研究内容和结果如下:1.E.coliγ-GGT基因的筛选和功能预测。从NCBI公共数据库中根据同源性筛选到1条γ-GGT基因（NCBI no.EG10374;E.coli K-12）,生物信息学分析表明其编码580个氨基酸,酶蛋白为酸性不稳定亲水性蛋白,分子量为61.7kDa,具有信号肽序列和保守的功能结构域,在细胞周质中发挥作用,在进化上较为保守。2.γ-GGT基因的E.coli工程菌构建。对E.coliγ-GGT基因进行乳酸菌偏嗜性改造后人工合成序列,与pET28a质粒连接后构建E.coli pET28a-GGT表达载体,经CaCl2法转化E.coli BL21菌株。菌落PCR和双酶切检测表明成功构建γ-GGT E.coli表达载体和重组工程菌。3.E.coli工程菌异源合成茶氨酸体系的建立。通过单因素实验和三因素三水平正交实验,对诱导温度、诱导剂浓度、诱导时间和不同底物浓度进行优化,建立E.coli工程菌异源合成茶氨酸体系:（1）重组蛋白的诱导。温度为30℃,IPTG浓度为0.2mmol/L时诱导4h;（2）GGT酶的催化反应体系。160rmp,30℃,1ml反应体系中（菌量70mg/ml,pH9.5）,谷氨酰胺（L-Gln）浓度为0.25M、盐酸乙胺浓度为2.0M,反应8h。该体系获得的茶氨酸含量为2932.02nmol/mL菌液。4.E.coli工程菌异源合成的茶氨酸活性分析。以茶氨酸标品和0.2%DMSO为对照,发现E.coli工程菌催化合成的茶氨酸（粗提液）对人体前列腺PC3癌细胞的增殖具有明显抑制作用,以粗提液50倍稀释时最为显著;茶氨酸粗提液对LTT T淋巴细胞具有保护作用,低稀释倍数时这种保护作用最为明显。5.γ-GGT基因的L.lactis工程菌构建。将经乳酸菌偏嗜性改造后的E.coliγ-GGT基因与pNZ804质粒连接构建表达载体pNZ8048-GGT,通过电击法转化乳酸菌。菌落PCR和双酶切检测表明,成功构建γ-GGT乳酸菌表达载体和获得L.lactis NZ3900/pNZ8048-GGT工程菌菌株。Real-time PCR分析发现,9株重组菌株中目的基因拷贝数分别为25、13、7、1207、204、443、1、18、6234、5943。6.L.lactis工程菌异源合成茶氨酸体系的建立。通过单因素和酶联免疫吸附试验（ELISA）对诱导剂Nisin的浓度和诱导时间进行优化。结果表明,采用3ng/ml的Nisin诱导表达4h时,由γ-GGT基因编码的γ-谷氨酰胺转肽酶酶活性最高。

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吕晶晶

导师: 宋莉,何劲

关键词: 茶氨酸,谷氨酰胺转肽酶,前列腺癌细胞,淋巴细胞,乳酸菌工程菌

来源: 贵州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 贵州大学

分类号: O629.71;Q78

总页数: 69

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