首页> 正文

非甲醇利用型毕赤酵母高表达重组蛋白菌株的构建及其转录组分析

2020-12-02阅读(828)

非甲醇利用型毕赤酵母高表达重组蛋白菌株的构建及其转录组分析

论文摘要

毕赤酵母已广泛应用于重组蛋白的表达,这主要得益于其高效的PAOX1,该启动子受甲醇的严格诱导,在其它碳源,如甘油、葡萄糖等碳源存在的情况下会被抑制。目前已对甘油或葡萄糖条件下,PAOX1的调控机制进行研究,发现调控PAOX1表达的激活性转录因子有Mxr1、Prm1和Mit1,抑制性的转录因子为Nrg1和Mig,并通过对这些转录因子进行改造获得了非甲醇依赖型的毕赤酵母表达系统。甲醇具有易燃易爆、有毒等特点,这限制了毕赤酵母在大规模发酵、食品和医药产品中的应用。毕赤酵母代谢甲醇时,需要消耗大量的能量合成醇氧化酶,其表达量占总可溶蛋白的30%。本研究通过对毕赤酵母中甲醇代谢途径相关调控基因的改造,获得非甲醇利用型的高产重组蛋白菌株,并通过转录组学方法深入分析菌株改造后基因表达的情况。具体研究内容和结果如下:（1）非甲醇利用型毕赤酵母高表达重组蛋白菌株的构建通过Cre/lox基因编辑体系,对甲醇代谢调控相关基因进行连续敲除,获得了ΔAOX1-WT,ΔAOX1/2-WT,ΔAOX1/2-ΔMig1-WT,ΔAOX1/2-ΔMig1/2-WT,ΔAOX1/2-ΔMig1/2-ΔNrg1-WT菌株,将这5株菌在甘油和甲醇混合的BMGYM培养基中进行发酵,其中ΔAOX1/2-WT菌株在0.4%甘油+0.5%甲醇的BMGYM培养基中重组蛋白的表达水平是最好的,EGFP表达量较WT在BMMY中提高了53.6%。说明敲除AOX基因之后,有利于菌体提高重组蛋白的合成能力。（2）非甲醇利用型毕赤酵母高表达重组蛋白菌株的转录组学分析利用转录组学方法深入分析了AOX基因敲除之后菌体代谢途径相关基因的表达情况。根据对差异表达基因富集分析的结果显示,基因表达水平变化最多的是细胞的代谢途径和基因信息加工途径,并且这两条途径大部分基因的表达水平都是上调的。菌体通过下调甘油转运蛋白GT1和甘油降解途径相关基因的表达水平,缓解甘油对PAOX1的抑制作用,实现在甘油存在的条件下PAOX1的表达。在细胞代谢途径中菌体通过上调糖酵解途径和PPP途径中的非氧化途径,以及下调TCA循环为菌体代谢提供充足的前体、辅因子以及能量物质。菌体还通过上调蛋白质翻译阶段中核糖体蛋白表达水平和内质网中与蛋白质加工分泌相关的基因,来提高蛋白的分泌表达量。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 英文缩略词表
  • 第一章 绪论
  •   1.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展
  •     1.1.1 毕赤酵母表达系统的发展
  •     1.1.2 毕赤酵母表达系统的优势
  •   1.2 毕赤酵母甲醇与甘油代谢途径
  •     1.2.1 毕赤酵母甲醇代谢途径及代谢过程中存在的问题
  •     1.2.2 毕赤酵母中甘油代谢途径
  • AOX1的调控机制'>  1.3 毕赤酵母PAOX1的调控机制
  •     1.3.1 毕赤酵母的碳源阻遏现象
  •     1.3.2 调控AOX1 基因表达的相关转录因子
  •   1.4 基于RNA-Seq技术的转录组研究
  •     1.4.1 转录组测序技术的概况
  •     1.4.2 RNA-Seq转录组测序技术的介绍
  •   1.5 本课题的研究意义及主要研究内容
  •     1.5.1 本课题的研究背景研究意义
  •     1.5.2 本课题的研究内容
  • 第二章 非甲醇利用型毕赤酵母高表达重组蛋白菌株的构建
  •   2.1 引言
  •   2.2 材料与设备
  •     2.2.1 主要仪器与设备
  •     2.2.2 主要试剂
  •     2.2.3 菌株、质粒与引物
  •     2.2.4 主要培养基和溶液的配制
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 敲除AOX及与甘油代谢阻遏相关基因的毕赤酵母菌株的构建
  •     2.3.2 AOX基因敲除结果的验证
  •     2.3.3 毕赤酵母改造菌株的摇瓶发酵
  •     2.3.4 菌液上清EGFP表达量的测定
  •   2.4 结果与讨论
  •     2.4.1 多基因敲除菌株的构建
  •     2.4.2 AOX基因敲除结果的验证
  •     2.4.3 敲除菌株EGFP表达量的测定
  •     2.4.4 高表达菌株甘油浓度的优化
  •   2.5 本章小结
  • 第三章 基于RNA-Seq的高表达重组蛋白ΔAOX1/2-WT菌株的转录组学分析
  •   3.1 引言
  •   3.2 材料与设备
  •     3.2.1 菌株与引物
  •     3.2.2 主要仪器和设备
  •     3.2.3 主要试剂
  •     3.2.4 主要培养基和溶液的配制
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 高表达敲除菌株的培养
  •     3.3.2 毕赤酵母总RNA的提取、反转录以及检测
  •     3.3.3 酵母转录组文库的构建及测序
  •     3.3.4 基因的定量及差异表达分析
  •     3.3.5 Real Time PCR鉴定基因表达量
  •   3.4 结果与讨论
  •     3.4.1 高产重组蛋白敲除菌株样品的准备
  •     3.4.2 毕赤酵母RNA样品的制备、处理与鉴定
  •     3.4.3 毕赤酵母转录组数据的概况与差异表达基因分析
  •     3.4.4 毕赤酵母代谢途径相关基因的转录组学分析
  •     3.4.5 转录组数据有效性的验证
  •   3.5 本章小结
  • 结论与展望
  •   结论
  •   本论文创新点
  •   展望
  • 参考文献
  • 附录
  • 攻读硕士学位期间取得的研究成果
  • 致谢
  • 附表

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 高娇

    导师: 林影

    关键词: 毕赤酵母,醇氧化酶,非甲醇利用型,转录组学

    来源: 华南理工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 华南理工大学

    分类号: Q78

    DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.001046

    总页数: 75

    文件大小: 3379K

    下载量: 106

    相关论文文献

    • [1].鸡血管生成素样蛋白4重组蛋白的原核表达及其对肉鸡血清生化指标和激素水平的影响[J]. 动物营养学报 2020(04)
    • [2].慢病毒载体——重组蛋白高效表达的新契机[J]. 分子诊断与治疗杂志 2013(06)
    • [3].链球菌表面三磷酸甘油醛脱氢酶及其突变体重组蛋白的表达和纯化[J]. 内蒙古农业大学学报(自然科学版) 2011(03)
    • [4].提高大肠杆菌可溶性重组蛋白表达产率的研究进展[J]. 中国生物工程杂志 2016(05)
    • [5].拟南芥根部芥子酶活性测定条件及其与重组蛋白酶学活性比较研究[J]. 中国农学通报 2012(27)
    • [6].人白介素-7重组蛋白的原核表达、纯化及活性测定[J]. 现代肿瘤医学 2015(23)
    • [7].链球菌表面烯醇化酶及其变异体重组蛋白的表达纯化[J]. 内蒙古农业大学学报(自然科学版) 2011(01)
    • [8].组织因子途径抑制因子重组蛋白表达和纯化方法的优化[J]. 天津医药 2009(01)
    • [9].白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶重组蛋白的制备及鉴定[J]. 临床检验杂志 2011(05)
    • [10].重组蛋白A在大肠杆菌中的分泌表达及活性测定[J]. 药物生物技术 2012(01)
    • [11].重组蛋白A免疫吸附剂的制备及吸附性能研究[J]. 北京化工大学学报(自然科学版) 2011(03)
    • [12].糖基化基因修饰对重组蛋白表达及活性的影响[J]. 中国生物制品学杂志 2018(09)
    • [13].超声对大肠杆菌生长和重组蛋白表达的影响[J]. 食品与发酵工业 2014(04)
    • [14].化脓性链球菌溶血素O活性结构重组蛋白的制备[J]. 中国生物工程杂志 2016(06)
    • [15].转基因烟草中一种酸性重组蛋白的纯化[J]. 中国医药工业杂志 2008(07)
    • [16].银杏抗菌肽蛋白基因原核表达及其重组蛋白的体内外抑菌作用研究[J]. 中国药房 2019(18)
    • [17].人可溶性生长刺激表达基因2蛋白的真核表达、纯化和鉴定[J]. 临床检验杂志 2020(02)
    • [18].猪血管紧张素转化酶2重组蛋白诱导表达和纯化条件的优化[J]. 南京农业大学学报 2019(02)
    • [19].小胸鳖甲胞外铜锌超氧化物歧化酶重组蛋白的原核表达及多克隆抗体制备[J]. 四川动物 2019(04)
    • [20].放线共生放线杆菌菌毛重组蛋白的提取及纯化[J]. 吉林大学学报(医学版) 2011(02)
    • [21].截短的猪繁殖与呼吸综合征ORF5基因及重组蛋白的原核表达[J]. 生物技术通报 2010(03)
    • [22].基于抗体等重组蛋白表达产品的哺乳动物细胞大规模发酵技术[J]. 中国医药生物技术 2009(05)
    • [23].我国已上市治疗用重组蛋白多肽类产品分析[J]. 中国药事 2019(09)
    • [24].水稻胚乳表达药用重组蛋白研究进展[J]. 中国新药杂志 2014(07)
    • [25].γ-氨基丁酸受体ρ2亚基重组蛋白构建及表达[J]. 新乡医学院学报 2018(01)
    • [26].链球菌蛋白G的结构域重构、表达及鉴定[J]. 中国动物传染病学报 2015(05)
    • [27].利用细胞工程技术改造重组蛋白生产用CHO细胞的研究进展[J]. 中国医药生物技术 2014(05)
    • [28].细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉抗原重组蛋白的表达、纯化及免疫学鉴定[J]. 宁夏医学院学报 2008(01)
    • [29].鸡HNF1α在大肠杆菌中的表达及其纯化[J]. 农业生物技术学报 2018(03)
    • [30].转移相关基因ABCE1编码蛋白的表达及鉴定[J]. 生物医学工程与临床 2017(03)

    标签：;  ;  ;  ;  

    非甲醇利用型毕赤酵母高表达重组蛋白菌株的构建及其转录组分析
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6