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miR-977在果蝇Toll免疫通路中的调控作用研究

2020-12-08阅读(849)

miR-977在果蝇Toll免疫通路中的调控作用研究

论文摘要

非编码RNA在各种生命过程中扮演着极其重要的角色,特别是microRNA（miRNA）一直是生命科学的热点研究领域。miRNA能在转录后水平调控基因表达对维持生物体内的稳态起着关键的作用。众所周知免疫响应的过度激活或不足都会造成生物体不同程度的损伤甚至导致疾病,因此,深入研究miRNA在动物免疫稳态维持中的功能和调控机制具有重要的理论和实践意义。黑腹果蝇因其具有易饲养、生长周期短、雌雄易辨、完整的全基因组序列、以及遗传资源丰富等特点,已成为研究动物免疫功能和免疫响应机制的重要模式生物。果蝇先天免疫主要是通过激活Toll信号通路与Imd信号通路产生抗菌肽（antimicrobial peptide,AMP）来抵抗外界病原微生物的侵染,而果蝇Toll信号通路和Imd信号通路也分别与哺乳生物中的TLR通路和TNF-α信号通路同源,它们在免疫响应调控中具有相同的进化起源。因此,深入研究miRNA在果蝇Toll和Imd信号通路中的调控机制,不仅对清晰地阐明miRNA在果蝇免疫稳态中的功能与作用机制具有重要的意义,而且也能为进一步揭示miRNA在昆虫先天免疫以及人类先天免疫中的调控作用机制提供重要的启示。为此,本论文围绕miRNA如何调控果蝇Toll信号免疫响应这一科学问题,开展了一系列的研究,获得了以下的主要结果:1.利用实时荧光定量（qRT-PCR）对革兰氏阳性菌藤黄微球菌（Micrococcus luteus,M.luteus）感染高表达miR-975/976/977果蝇后6个时间点的抗菌肽（Drosomycin,Drs）基因的表达进行了定量分析,发现感染后24h与48h的miR-975/976/977高表达果蝇的Drs显著下调;同时利用qRT-PCR方法进一步检测了基因缺陷型miR-975/976/977 KO果蝇Drs表达在12h、24h、48h呈显著上调,这些结果揭示miR-975/976/977能够负调控果蝇Toll信号免疫响应。2.为确定miR-975/976/977这一簇中是哪一种或哪几种miRNA调控果蝇Drs表达,我们进一步利用qRT-PCR分别检测了miR-975、miR-976、miR-977高表达果蝇感染后6个时间点体内Drs表达情况,结果发现只有miR-977与miR-975/976/977簇结果一致,都能够负调控果蝇Drs的表达。3.为了进一步揭示miR-977负调控Toll信号响应的机制,我们利用miRanda与TargetScan的程序对miR-977可能调控的靶基因进行预测,取交集后发现miRNA-977能够靶向果蝇Toll信号通路中的Toll、myd88和Dif。4.利用qRT-PCR检测果蝇体内Toll、myd88、Dif基因的表达水平,根据定量结果发现miR-977只能靶向Dif基因。5.基于miR-977的双荧光素酶报告系统分析结果,发现miR-977免疫调控功能主要是通过靶向果蝇Toll信号通路下游转录因子Dif的Dif-RA/RB/RD三个转录本来负调控Drs表达。总之,本文研究发现了miR-977是一种新的负调控因子参与果蝇Toll信号免疫响应的负调控,并且揭示了miR-977是通过调控Dif-RA/RB/RD三个转录本的表达,从而负调控果蝇Toll免疫响应;同时本文的研究也阐明了miRNA在革兰氏阳性细菌感染果蝇Toll介导的先天免疫应答中起着重要的调控作用。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 绪论
  •   1.1 果蝇
  •   1.2 果蝇的先天免疫
  •     1.2.1 体液免疫
  •       1.2.1.1 Toll信号通路
  •       1.2.1.2 Imd信号通路
  •     1.2.2 细胞免疫
  •   1.3 microRNA
  •     1.3.1 miRNA的发现
  •     1.3.2 miRNA产生过程
  •     1.3.3 miRNA的研究现状
  •   1.4 本论文的研究意义
  •   1.5 本论文的技术路线
  • 第2章 miR-975/976/977 对果蝇Toll信号通路的负调控作用
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验材料、试剂、仪器
  •     2.2.1 材料
  •     2.2.2 试剂
  •     2.2.3 仪器
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 果蝇的饲养
  •     2.3.2 果蝇的杂交
  •     2.3.3 果蝇的样品收集
  •     2.3.4 菌种刺激果蝇样品
  •     2.3.5 果蝇的总RNA提取
  •     2.3.6 RT-PCR检测果蝇抗菌肽基因的含量
  •   2.4 实验结果
  •     2.4.1 构建miR-975/976/977 高表达果蝇
  •     2.4.2 miR-975/976/977 高表达果蝇在M.luteus刺激后抗菌肽Drs的表达水平检测
  •     2.4.3 miR-975/976/977 敲除果蝇在M.luteus刺激后抗菌肽Drs的表达水平检测
  •     2.4.4 miR-975/976/977 异常表达在感染革兰氏阳性致死菌E.faecalis后生存情况观察分析
  •   2.5 讨论
  • 第3章 miR-977 对果蝇Toll信号通路的负调控功能
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验材料、试剂、仪器
  •     3.2.1 材料
  •     3.2.2 试剂
  •     3.2.3 仪器
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 果蝇的培养
  •     3.3.2 果蝇的杂交
  •     3.3.3 果蝇的样品收集
  •     3.3.4 菌种刺激果蝇样品
  •     3.3.5 果蝇的总RNA提取
  •     3.3.6 RT-PCR检测抗菌肽基因的含量
  •   3.4 实验结果
  •     3.4.1 构建miR-975、miR-976、miR-977 高表达果蝇
  •     3.4.2 miR-975、miR-976、miR-977 高表达果蝇在M.luteus刺激后Drs的表达情况
  •     3.4.3 野生型果蝇在M.luteus刺激后体内miR-977 的表达变化模式
  •   3.5 讨论
  • 第4章 miR-977 潜在Toll通路相关靶基因的预测分析
  •   4.1 引言
  •   4.2 预测原则
  •   4.3 预测软件
  •     4.3.1 miRanda预测软件
  •     4.3.2 TargetScan预测软件
  •   4.4 预测结果
  •     4.4.1 miR-977 的靶基因预测结果
  •     4.4.2 miR-977 靶基因的位点结合信息
  •   4.5 讨论
  • 第5章 miR-977 靶标基因的体内验证
  •   5.1 引言
  •   5.2 实验材料、试剂、仪器
  •     5.2.1 材料
  •     5.2.2 试剂
  •     5.2.3 仪器
  •   5.3 实验方法
  •     5.3.1 果蝇的培养及杂交
  •     5.3.2 果蝇的样品收集
  •     5.3.3 菌种刺激果蝇样品
  •     5.3.4 果蝇总RNA的提取
  •     5.3.5 RT-PCR检测果蝇靶标基因的含量
  •   5.4 实验结果
  •     5.4.1 构建miR-977 高表达果蝇
  •     5.4.2 qRT-PCR检测miR-977 高表达果蝇体内其潜在靶标基因的表达水平
  •   5.5 讨论
  • 第6章 miR-977 靶标基因的体外验证
  •   6.1 引言
  •   6.2 实验材料、试剂、仪器
  •     6.2.1 材料
  •     6.2.2 试剂
  •     6.2.3 仪器
  •   6.3 实验方法
  •     6.3.1 果蝇S2 细胞的培养
  •     6.3.2 质粒构建与抽提
  •     6.3.3 细胞转染
  •   6.4 实验结果
  •     6.4.1 双荧光素酶报告系统原理
  •     6.4.2 双荧光素酶报告检测结果
  •   6.5 讨论
  • 第7章 结论
  • 附录
  • 参考文献
  • 在读期间发表的学术论文及研究成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 黄钰

    导师: 许晓风

    关键词: 黑腹果蝇,信号通路

    来源: 南京师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 南京师范大学

    分类号: Q352

    DOI: 10.27245/d.cnki.gnjsu.2019.001054

    总页数: 74

    文件大小: 6058K

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