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摘要：肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病,恶性肿瘤的转移是肿瘤治疗失败的主要原因,临床90%以上的癌症患者死于肿瘤的转移[1].前列腺癌等恶性肿瘤其早期症状不明显,但往往诊断时已经到达中晚期,失去手术机会[2].因此开发推广有效、准确、廉价的肿瘤临床诊断技术对于挽救患者生命有着重要意义.
微流控芯片作为一种有着广阔应用前景的新技术,可灵活设计的芯片结构使其能够实现高灵敏度、高通量、快速和大规模分析,可用于高效的肿瘤诊断.同时,精确控制物质浓度梯度和微流体,采用凝胶等代替细胞外基质能更真实模拟细胞在体内生长微环境[3],以便用于完成对患者细胞的实时监测.因此,微流控芯片的应用将有助于深入了解患者病情并获得有意义的治疗方案,为临床诊疗奠定基础.本文简要综述了国内微流控芯片在肿瘤临床的最新应用情况.
关键词：微流控芯片临床肿瘤诊断肿瘤转移循环肿瘤细胞
1循环肿瘤细胞的检测与捕获培养
1.1分选富集血液中的循环肿瘤细胞
刘大渔等[4]加工了一种封接有多孔聚碳酸酯薄膜的过滤式微流控芯片用于循环肿瘤细胞分选.该芯片通过肿瘤细胞与血细胞在大小和变形能力方面的差异来选择性地分选出肿瘤细胞,而且可以在芯片上完成对循环肿瘤细胞的过滤、固定、标记和计数.该芯片由两层PDMS制成,具有12个辐射排列状的过滤单元,其主要结构为进样通道、引流通道及过滤池.借助8μm孔径的PC滤膜,可以选择性截留作为模型的Hela细胞,在500μL/min流速下能够达到85%的回收率,而血细胞残留可控制在3000个以下.该芯片只需血液即可检测而且操作简便，有望成为一种实用的临床肿瘤检测技术.
1.2微流控芯片对肿瘤细胞的捕获及再培养
桑维维等[5]利用MUC1抗体（与腺癌特别是乳腺癌的癌细胞恶变、转移和浸润密切相关的一类高分子糖蛋白）修饰的芯片捕获乳腺癌细胞(MDA-MB-231),之后用PBS冲洗使其释放并实现再培养.该芯片使用MUC1抗体修饰后能有效地捕获肿瘤细胞，而且释放率较高,约为98%.用抗肿瘤药物阿霉素处理再培养的细胞并与正常细胞对照,分析其基因表达情况发现并无显著差异,可以认为捕获及再培养过程对肿瘤细胞的药物敏感性影响较小.该芯片为临床肿瘤细胞的捕获与检测以及针对性的治疗提供了新的可能,有望用于患者肿瘤细胞的进一步研究和个体化治疗方案设计.
2基于分子水平和基因水平的细胞检测
2.1检测患者血浆中p16基因甲基化
p16基因是一种可以抑制肿瘤发生的基因,调控G1期向S期转变从而调节细胞增殖[6].其启动子区甲基化被认为是肺癌的早期标志[7],在肺癌的早期诊断有着客观的应用前景.汪洋等[8]对肺癌患者血浆标本中的DNA进行甲基化特异性PCR扩增,分别使用琼脂糖凝胶电泳和微流控芯片检测,后者灵敏度高出前者36.36%,有效减少了检测方法灵敏度有限导致的假阳性结果.该检测方法更加准确地反映出p16甲基化状态,而且成本低廉,有望广泛应用于肺癌的筛查.
2.2检测患者单个细胞的特定蛋白表达量诊断白血病
宋敬敬等[9]使用微流控芯片捕获白血病患者的的单个细胞,借助MPO染液分析细胞髓过氧化物酶(MPO)表达情况,避免了联苯胺法周围存在红细胞导致的重叠集聚现象.该微流控芯片结构简单,操作相对容易,便于动态观察研究,能高效快速地实现分析.因此有望作为单核细胞白血病标志物的检测手段,提高白血病诊断的准确度.
2.3检测患者单个细胞特定基因突变
孙帅等[10]分离了血液中的肿瘤循环细胞,利用显微操作仪获取单个细胞,大量扩增其DNA后使用设计好的引物扩增EGFR基因,根据扩增结果检测是否发生了突变.EGFR是一种对细胞的增殖和分化发挥重要的作用的信号传导受体,使用微流控芯片可以准确便捷地检测患者的EGFR是否突变,有望促进临床诊疗的进步.
3基于定量分析的细胞检测
3.1通过物质浓度梯度定量分析肿瘤细胞转移能力
2013年,陈哲周[11]建立了一种基于微流控芯片研究肿瘤细胞侵袭能力的定量分析方法.该方法通过在微流控芯片上构建敞开式侵袭通道以便细胞收集,并持续向该芯片泵液以形成稳定的浓度梯度,在保持细胞活性的同时为细胞侵袭提供选择压力.此外,该芯片中的基质胶可以模拟体内细胞侵袭的环境,测定肿瘤细胞在基质胶上侵袭的距离可以作为定量分析其侵袭能力的依据.侵袭能力决定了肿瘤细胞能否侵入血管,也决定了肿瘤的转移能力,因此,该系统为肿瘤患者病情的定量分析和精确诊断提供了新的方法,有望用于分析恶性肿瘤患者病情.
4总结
在对肿瘤的临床检测中,针对肿瘤循环细胞的检测有着成本低、速度快、富集后的细胞活性较高等特点,但特异性不高,血细胞的干扰问题仍然难以克服.而基于分子水平和基因水平的单个细胞检测,虽然准确度较高,但可能存在偶然性和局限性,检测后的细胞又难以用于后续的研究和验证.因此还需一种能取长补短的检测方法,以便于准确判断患者病情,进行针对性的治疗.若使用微流控芯片捕获肿瘤循环细胞后通过调控pH、渗透压和离子浓度等要素模拟出不适合普通血细胞生存的特定微环境,在基质胶上筛选、培养肿瘤细胞.进而可以获取足够细胞以进行多次单个细胞的检测,使结果更加可靠,并且根据基质胶上的侵袭距离还可以定量分析其转移能力.这将为肿瘤的临床诊断提供更准确可靠的参考依据.
参考文献
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[2]朱圣生,刘向云,孙祖越.前列腺特异性抗原衍生体及前列腺癌高特异性生物标志研究现状[J].中国药理学与毒理学杂志,2013,27(1).
[3]刘雯婷,陈红梅,聂富强.基于微流控芯片的细胞迁移[J].科学通报,2016(3):364-373.
[4]刘大渔,严伟,张琼,马薇,梁广铁.过滤式微流控芯片上的循环肿瘤细胞分选.《分子诊断与治疗杂志》,2012(6):366-370
[5]桑维维,常亚男,李娟.微流控芯片对乳腺癌细胞MDA-MB-231的捕获及再培养研究.《中国生物工程杂志》,2015,35(6):46-53
[6]詹銮峰,张卓然,李士军.p16基因及其与肿瘤发病的关系(文献综述)[J].国际外科学杂志,2004,31(4):212-214.
[7]张团结.p16基因甲基化检测在肺癌诊断中的意义[J].吉林医学,2014(23):5237-5237.
[8]汪洋,邹丽娟,许冠东,etal.微流控芯片检测肺癌患者血浆中P16基因异常甲基化在临床应用的评价[J].生物化学与生物物理进展,2004,31(12).
[9]宋敬敬,李晓亮,兰杰,etal.微流控芯片分析M4患者CD14~+单核细胞中MPO表达[J].中国肿瘤临床,2014(12):771-775.
[10]孙帅,邓宇亮.肺癌循环肿瘤细胞的单细胞EGFR基因突变检测[J].遗传,2015(12):1251-1257.
[11]陈哲周.基于微流控芯片的肿瘤细胞侵袭力定量分析系统的建立及应用研究.中国医科大学,2013