刘友勋[1]2003年在《水稻细条病菌毒力分化及遗传多样性研究》文中研究表明以针刺接种法，研究了20个水稻品种与40株稻细条病菌的互作关系。通过对品种的抗感性和生育性的比较，选出金刚30、窄叶青、XM5、XM6、M41作为鉴别品种，以此为基础，40株稻细条病菌被划分成0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ等7个型，与浙江、广东、湖南所用鉴别品种的鉴别性相比较，此套鉴别品种可以鉴别出病菌毒力呈强弱性反应的数量变化和呈互作交叉性反应的质量变化。 以金刚30、窄叶青、XM5、XM6、M41等5个品种为鉴别品种，将来自4省的75个细条病菌菌株的毒力划分为0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ等7个致病型，各型在鉴别品种上的反应依次为RRRRR、SRRRR、SSRRR、SSSRR、SSSSR、SSRSR、SRSRR。0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型毒力差异主要呈由弱到强的数量变化，Ⅴ和Ⅵ型间呈强互作反应。各型菌所占比例：0型5.3％、Ⅰ型9.3％、Ⅱ型20％、Ⅲ型44％、Ⅳ型10.7％、Ⅴ型6.7％、Ⅵ型4％；4省菌株毒力的初步比较表明，福建、江西以Ⅲ、Ⅳ型菌为主，依次占参试菌的88％、50％；湖北以Ⅱ、Ⅲ型菌为主，占参试菌的70％；湖南没表现突出的优势群，但较强毒力的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型菌所占比例为55.6％；湖北省内不同稻区，病菌毒力也不尽相同。 在金刚30、窄叶青、XM5、XM6、M41等5个品种上，对冰箱保存的水稻细条病菌0型菌RHL1-2、Ⅱ型菌RJ3-2、Ⅲ型菌RJX3-2、Ⅳ型菌RH2-2(母菌)和它们的单细胞系的致病力进行了比较，结果表明：0型菌RHL1-2和它的9个单细胞系都表现为0型；Ⅱ型菌RJ3-2致病力降为了0型，它的9个单细胞系也都表现为0型；Ⅲ型菌RJX3-2降为了Ⅱ型，其单细胞系中，1个Ⅰ型，3个Ⅱ型，5个Ⅲ型；Ⅳ型菌RH2-2致病力降为了Ⅱ型，其单细胞系中，4个0型，1个Ⅰ型，2个Ⅱ型，1个Ⅲ型，1个Ⅵ型；用新复极差法测定Ⅲ型菌RJX3-2、Ⅳ型菌RH2-2的单细胞系在品种金刚30、窄叶青、XM5上的毒力，均有显着差异；说明，从病叶上分离的原始菌株一定是由不同毒力的单细胞系组成的混合体，在冰箱保存期间，不同毒力的单细胞系的存活率不同，导致活化后的母株的单细胞系组成比发生变化，从而使致病力发生了改变。 采用引物BOX和ERIC对来自4省的35个细条病菌菌株进行Rep-PCR扩增，BOX引物扩增出14条指纹带，10种谱型，以致病型为单位计算遗传多样性值为0.63～1.00；ERIC引物扩增出19条指纹带，17种谱型，遗传多样性值为0.86～1，可见引物ERIC比BOX在遗传多样性方面有更好的分辨率；树状聚类图中反映的遗传分簇差异，与菌株的致病型及其地理的来源之间没有相关性。 用BOX或ERIC为引物对4个母株和它们的36个单细胞进行PCR扩增，结果表明，同一母株的单细胞系之间，存在遗传差异，‘不同母株的单细胞系的遗传差异程度不同。在ERIC一PCR聚类图中，RJX3一2和其单细胞系之间的异源率达到27.3%水平，说明母株一定是含不同单细胞系的混合体。但这种差异与菌株的毒力分化无明显相关性。
张桂英[2]2009年在《中国、日本、菲律宾水稻白叶枯菌致病性和遗传多样性分析及文库克隆pA254的功能研究》文中认为水稻黄单胞菌的两个致病变种水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola, Xooc)是模式植物水稻(Oryza sativa)上的两种模式病原菌,分别引起水稻白叶枯病(bacterial blight, BB)和水稻细菌性条斑病(bacterial leaf streak, BLS),影响了亚洲大部分、非洲部分地区主要粮食作物的生产。水稻白叶枯菌(Xoo)从被发现至今100多年的历史中,一直是植物病理学研究者关注的焦点。研究水稻抗病基因(R)和Xoo无毒基因(A)的互作是阐明抗病基因和Xoo的致病性分化、鉴定小种、无毒基因、致病基因等的基本依据,也是发展有效的病害防治措施的需要。Xoo的小种分化涉及到对现有抗病品种的潜在利用价值。各国的Xoo代表菌株在科研和生产实践中都具有十分重要的意义。在寄主植物上的过敏反应HR最初被认为是一种“抗病现象”受到广泛关注,而病原细菌在非寄主烟草上的HR症状也是判定一个细菌分离物是否具有植物致病性的重要指标。由于HR现象与植物病原菌的致病性及寄主和非寄主植物的抗病性或内生免疫有着重要的关系,因此,研究Xoo菌株在寄主水稻上产生HR相关的avrBs3/pthA家族无毒基因和使非寄主烟草丧失产生HR的文库克隆pA254的组成和功能为更好地阐释植物细菌致病机理,植物病害抗病机理和植物与微生物学的其他方面的基本原理,同时也为内生免疫等方面带来重要启示。1 Xoo代表菌株致病多样性分析通过苗期注射接种法和成株期剪叶接种法,研究了20个来自中国、日本和菲律宾的Xoo不同致病型的代表菌株与36个水稻品种的互作关系。Xoo注射接种入14d的36个水稻品种的叶片中进行非亲和互作的HR表型测定,并对接种后第2-5d的接种叶片进行DAB溶液染色,检测接种叶片中活性氧爆发的情况,来观察HR发生情况。结果显示OS-198与所测试36个水稻品种苗期叶片中都发生有不同程度的非亲和互作,PX061、JXOI、OS-189菌株等与所测试36个品种中大多数品种之间存在特异性互作关系。Xoo注射接种所产生的症状是一复杂的表型,JXOI与IRBB1、IRBB2等发生特异性的互作,产生肉眼可见的典型的HR症状,表现出质量性状,但是更普遍现象是多数的Xoo在水稻品种上产生一种混合症状,即water-soaking症状和HR反应同时存在,但是病斑长度没有明显的变化,推测Xoo中所含有多数的avrBs3/pthA基因具有的无毒性属于一种数量累加效应,不是质量性状。研究结果明确了白叶枯菌与水稻近等基因系等36个水稻品种的互作关系,报道了在Xoo-水稻互作系统中的非亲和性互作与氧爆发的关系,推测不同代表菌株中可能含有的无毒基因,这为克隆对应R基因的无毒基因以及揭示水稻黄单胞菌致病性变异机制奠定了工作基础和提供了科学线索和依据。成株期剪叶接种结果显示在36个水稻品种中,基因累加品系IRBB54(xa5+Xa21)和IRBB55(xa13+Xa21)抗所有测试菌株,在20个测试菌株中,没有发现对36个水稻品种都致病的菌株。带有显性抗病基因Xa4、Xa7、Xal7、Xa21和隐性抗病基因xa5、xa13、xa24的水稻品种对50%以上的测试代表菌株抗病,而带显性抗病基因Xa1、Xa2、Xa10、Xa11、Xa12、Xa14、Xa18和隐性抗病基因xa8、xa19、xa20的水稻品种对50%以上的测试的代表菌株感病,籼稻IRBB3(Xa3)感病的品种也超过50%。IRBB21(Xa21)拥有最广的单基因抗性谱。IRBB54和IRBB55是抗病表现最好的双抗病基因组合的品种。常规品种TN-1感所有的测试菌株,IR26、BJ1、Asminori、Wase Aikoku 3和DV85对60%以上的测试菌有抗性.IR24、Java14、Tetep和Cas209对60%以上的测试菌感病。Xoo在36个水稻品种上的致病表型把测试菌株分成19个致病型,每个代表菌株的致病性各不相同。根据致病型的相似性,19个致病型可聚成7个类群(Cluster),聚类群3是优势群,分布最广,包含有测试的3国的代表菌株。2 Xoo代表菌株的小种遗传多样性分析有证据表明水稻黄单胞菌都含有15个以上的avrBs3/pthA家族基因,它们具有几乎一样的5'端和3'端,不同的只是中间102 bp重复单元的重复数不同。本研究参照PXO99A全基因组序列中已知的avrBs3/pthA基因的组成、数目和序列,以avrBs3/pthA家族成员avrXa3的中间保守区域大小为2.4kb-BamHI和1.4kb-SphI的中间片段为探针,对20个Xoo的代表菌株和Xooc菌株RS105的分别用BamHI和SphI酶切的基因组DNA进行Southern杂交作RFLP分析。杂交结果显示Xoo中很高的avrBs3/pthA家族成员遗传组成多样性。发现Xoo的不同小种间所含有的avrBs3/pthA基因的拷贝数不同,有些条带在所有的小种中都存在,有些条带是某个小种所特有的。发现探针的同源片段主要集中在1000bp到5000bp这个区间,意味着102bp的重复数大约有9-50个,每个菌株有12-38个同源拷贝。各国水稻白叶枯菌间至少共有4.3kb、4.0kb、3.9kb、3.8kb、3.5kb、3.1kb、2.8kb大小的BamHI片段或3.2kb、2.9kb、2.8kb、2.5kb、2.3kb、2.1kb、1.8kb大小的SphI片段的7个大小相同或相近的avrBs3/pthA家族基因。这些共有的基因在维护和展现水稻白叶枯菌的共性特征方面发挥着重要的作用。20个参试菌中总共鉴定了19种RFLP分子型(haplotype),根据分子型的相似性分为7个系群(Lineage).3.Xoo菌株PXO99A的无毒基因缺失突变分析水稻白叶枯菌中含有数目不等的无毒基因,但对大多数无毒基因的功能所知甚少。通过对同源重组获得的一个PXO99A无毒基因的突变体PXO99Δavr,进行Southern杂交验证、突变序列分析和水稻成株期剪叶接种的致病性测定。结果证实了突变体缺失了5个无毒基因,同源重组发生在PXO99A全基因组中一个有5个无毒基因串连的位点上。水稻成株期致病性测定结果表明突变体PXO99Δavr在IRBB10等15个水稻品种上的病斑长度比PXO99A明显缩短,在IRBB14、IRBB21和IRBB55上病斑变长,缺失的5个无毒基因的的综合表现为毒性因子功能。推断在缺失的基因中含有无毒基因avrXa14、avrXa21、avrxal3以及和抗病基因Xa3、Xa4、xa5、Xa10、Xal7亲和互作有关的毒性因子。为利用自杀式载体pKNG101建立模式菌株PXO99A的无毒基因缺失突变体库,进一步研究PXO99A中各无毒基因的功能做了一些初步的探索。4.无毒基因avrXa3介导的水稻白叶枯病菌在不同水稻品种上的致病适应性分析从水稻白叶枯JXOIII菌株中克隆到一个无毒基因avrXa3,它属于avrBs3/pthA家族成员。根据无毒基因avrXa3的序列,构建了水稻白叶枯PXO99A菌株缺失5个串联的无毒基因的突变体PXO99Δavr。将avrXa3导入PXO99A和PXO99Δavr后,得到衍生菌株PXO99A/avrXa3, PXO99Δavr/avrXa3,与36个含不同抗病基因的水稻品种进行互作分析。结果显示导入avrXa3后的菌株在不同的水稻品种上表现出了明显的寄生适应性变化。进一步分析证明无毒基因avrXa3在Wase Aikoku 3、IRBB2、IRBB3、IRBB203、IRBB204、IRBB205、IRBB211、IRBB53、IR24、TN-1等11个水稻上病斑缩短,表现明显的无毒活性；在IRBB21、IRBB10、IRBB14、IR26、Cas209、Java14等6个品种病斑明显变长,体现无毒基因的毒性功能。实验结果表明,无毒基因avrXa 3对PXO99A中其它无毒基因的表达有明显干扰作用,单个效应分子的变化也会使细菌在不同水稻品种上的寄生适应性发生复杂的改变。5.Xoo菌株与非寄主HR相关的PXO99A基因文库克隆pA254的功能分析来源于水稻白叶枯病菌PXO99A的文库克隆pA254,分别使水稻黄单胞菌PXO99A和RS105的致病力下降及丧失在烟草上激发过敏反应的能力。用SacI、EcoRI、KpnI和BamHI四种内切酶进行了交叉消化,构建了文库克隆pA254的酶切物理图谱。亚克隆导入RS105进行功能互补,在烟草上进行HR测定。结果显示亚克隆获得SacI, KpnI, EcoRl, BamHI完全和不完全酶切的29个亚克隆,导入RS105得到的接合子,都可以使烟草产生HR反应,没有与文库克隆pA254表型一致的亚克隆,即还未获得pA254的最小的功能片段。对所获得的pA254的亚克隆进行测序分析,通过序列同源性分析发现pA254与已经公布的PX099A的全基因组序列100%同源,与另外2个水稻白叶枯病菌具有99%以上同源性。这个克隆带有的外源片段大小为42572bp,位于PX099A基因组序列中相对保守的区域,包含约46个基因,也分别和MAFF11081和KACC10331中的37和42个基因同源。其中发现有毒力调控子基因、毒力蛋白基因、转录抑制子和含HTH基序的转录调控子等毒力相关因子,另外还有12个为未知功能基因,推测为保守的蛋白,4个转座酶基因,4个DNA连接酶,3个细胞色素C氧化还原酶,2个谷胱甘肽S转移酶,2个氨基酸-tRNA(Asp)合成酶,2个饥饿胁迫蛋白,2个抑制子(多羟基链烷酸合成抑制子),有一个乙酰辅酶Co-A还原酶,GumN蛋白和脂蛋白,YjeF家族蛋白,DNA错配修复酶,铁硫簇结合蛋白,乙酰丙氨酸酰胺酶,脱氧核糖核酸酶(亦称DNase),核糖核酸酶,可溶解胞壁转糖基酶等。文库克隆中有一大小约21kb的序列具有基因岛或致病岛的许多典型特征：带有1个或多个毒力相关因子、它们有明显的GC含量的变化,在连接处有整合酶基因,边界有tRNA作为整合位点,还有多个遗传移动性基因转座酶基因以及氨基酸偏爱密码子等。推测文库克隆pA254是hrp致病岛以外另一个和非寄主HR有关新的致病岛或基因岛(genomic island)。
曾建敏[3]2003年在《水稻对细菌性条斑病菌侵染反应的分子机理研究》文中研究指明水稻细菌性条斑病，简称细条病(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)，是我国南方稻区的主要病害之一。轻发田一般减产15％～25％，严重的可达40％～60％。因而明确水稻细条病病原菌致病性和水稻抗性遗传机理及其相互作用的分子基础，从本质上阐明由病原菌诱导的抗性基因表达与调控的分子生态学机理，对于有效控制水稻细条病的发生与发展、减少经济损失具有重要的理论和现实意义。 本研究以高抗细条病的水稻品种佳辐占成熟胚的愈伤组织为材料，用南方稻区强毒力细条病菌菌株进行人工接种，通过DDRT-PCR技术，共找到60个大小在179bp-700bp之间受Xooc侵染诱导或抑制表达的cDNA差异片段。其中50个差异片段为接种Xooc的水稻愈伤组织所特有的，另外10个为未接种Xooc的水稻愈伤组织所特有的。回收这些cDNA差异片段后进行二次扩增，并采用RDB(reverse dot-blotting)杂交进行阳性鉴定，结果得到4个阳性克隆。通过BLAST软件将这4个阳性克隆同基因文库中的序列进行同源性比对，发现24-21克隆位于水稻第10号染色体的nbeb0039C14克隆(GenBank Acc:AC087549)上；39-34克隆位于水稻第5染色体的BAC克隆OSJNBb0086G17(GenBank Acc:AC144455)上；45-11克隆位于水稻第1染色体的PAC克隆P0410E03(GenBank Acc:AP002844)上；55-34克隆位于水稻第10染色体的OSJNBa0060A14克隆(GenBank Acc:AC021893)上。 通过与表达库(EST)中的序列同源性比对结果表明，24-21克隆与NaCl胁迫的水稻根系cDNA克隆ID1561(GenBank Acc:BE607423)同源性达97％，且E期望值达3e-82，还与野蚕(Bombyx mandarina)的cDNA克隆H109(GenBank Acc:AT001109)具9％的同源性。39-34克隆包含一个小粒稻(Oryza minuta)HybriZAP-2.1 XR库的cDNA克隆OML00455(GenBank Acc:CB210175)，并与稻瘟病菌(M.grisea)诱导的水稻cDNA克隆OSJNEb09A05(GenBank Acc:CB646488)和OSJNEb09B24(GenBank Acc:CB646568)、水稻花期穗的cDNA克隆E2428(GenBank Acc:AU094102)、短日照条件下水稻幼叶的cDNA克隆E60992(GenBank Acc:AU095268)以及NaCl胁迫水稻根系的cDNA克隆BR030002000＿PLATE＿E11＿85＿086.abl(GenBank Acc:CA754595)部分同源。45-11克隆与浸水胁迫大麦根的cDNA克隆EBro03＿SQ005＿D03(GenBank 福建农林大学硕士学位论文^ec:BQ763644)、大麦授粉ld后幼胚的eDNA克隆so00020003oA08FI(GenBankAee:月434386)‘、稻瘟病菌诱导获得的水稻eDNA克隆VoolA03(GenBankAee:BM42 1 151)和水稻细条病菌(BLS222)诱导的玉米叶片的eDNA克隆Rxo一2_Bos (GenBank Aee:eA452438)以及九eeinia 50烤儿1 isolate州l诱导的玉米叶片eDN^克隆RP3A一2少03(GenBank Aee:CA452784)等具有42一420bp大小不等的同源性。55一34克隆与浸水大麦根的。DNA克隆EBroo3_sQoo妇17(GenBank Aee:BQ765947)、高粱胚(EMI)的eDNA克隆EMI_52一05.91_AooZ(GenBank Aee:BG464036)、禾谷镰抱菌(尸脚minearum)诱导的小麦 eDNA克隆Tao屯13908(GenBank Aee:BQgol614)、白粉病菌(丑脚min心￡sP沉tici)诱导的小麦eDNA克隆wlmo，pk041.o7(GenBankAcc:cA658271)等具有较高的同源性，且与一个水稻花期穗的cDNA克隆Eos 16(GenBank Ae。:^ul72440)具有417bP大小的同源。 从推定的氨基酸序列的同源性比对分析发现，24一21克隆的氨基酸序列是一个新的序列;39一34克隆的氨基酸序列除了与ATI基因(h。。k一coniaining protein ATI)(GenBank Acc:557459)有34个氨基酸的同源外，还与金黄色葡萄球菌(及叩勺lococ二auras)的转移复合蛋白(transfer eomPlex nrotein TrsE)(GenBank Aee:F36891)、NADH脱氢酶亚基(dehydrogenase sub画t)4[Che之rogaleus oedius](GenBank Aee:AAK705 14)等有一定的同源性;而45一11克隆的氨基酸序列则仅与PDR一like ABC transPorter团。夕之口sarivaC即onica eultivar一gro即)」(GenBank Aee:CAD59568)具有同源。55一34克隆的氨基酸序列与推定的水稻果胶甲基醋酶(Putative pectin methylesterase)(GenBank Acc:AAK98683)具有73个氨基酸的同源性，且同源性(Identities)和正确性(Positives)均为98%，还与拟南芥假定的蛋白(GenBank Acc:H 86187)和推定的花粉特异果胶酷酶(pollen一speeifle peetinesterase，putative)(GenBank Aee:Np_191776)等具有较高的同源性。文中还就如何应用现有分离得到的相关基因进一步开展抗性生理与分子生态学研究作了探讨。
傅晶[4]2010年在《抑制病原菌诱导的生长素的积累赋予水稻广谱抗性》文中认为水稻是人类的主要粮食作物之一。白叶枯病、稻瘟病以及细菌性条斑病是造成水稻减产的罪魁祸首。研究和发掘具有广谱抗性的水稻抗病相关基因为培育水稻优良抗性品种提供了理论基础。本研究旨在运用植物分子生物学和生物化学领域的前沿技术,揭示了水稻中一个GH3基因家族成员在抗病反应中的作用机理。我们利用QTL分析确证了GH3-2与几个抗白叶枯的微效抗性QTL以及多个抗稻瘟病的微效抗性QTL相对应。通过农杆菌介导的遗传转化在高感白叶枯的粳稻品种牡丹江8超量表达GH3-2,在中感白叶枯的粳稻品种中花11中利用RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)抑制GH3-2的表达。GH3-2超量表达的植株株型变矮,且对白叶枯病菌,稻瘟病菌和细条病菌均表现出增强的抗性。通过Northern检测证明了矮化表型及提高的抗性均与GH3-2的表达量成共分离的关系。然而GH3-2抑制表达的植株在株型及抗性方面均与野生型及转基因阴性植株类似,可能因为该基因与其基因家族中的其他成员存在功能冗余。GH3-2超量表达植株接种白叶枯菌后,病程相关基因PRla和PRlb,水杨酸合成相关基因PAD4和PAL1,茉莉酸合成相关基因LOX、AOS2和PR10,以及细胞延伸蛋白(expansins) EXPAl、EXPA5和EXPA10的表达与野生型对照相比均受到抑制。通过激素含量测定实验证明了GH3-2超量表达植株的水杨酸和茉莉酸含量均下降。据此我们推断GH3-2介导的水稻对白叶枯的抗性不需要激活水杨酸和茉莉酸途径,而是与细胞的细胞壁松弛有关。我们在体外表达并纯化了带有His标签GH3-2蛋白。酶活测验证明GH3-2蛋白具有吲哚-3-乙酸(IAA)酰胺合成酶活性。激素含量测定实验也证实了与野生型相比,GH3-2超量表达植株的生长素IAA含量降低,而IAA-Asp的含量升高,从体内验证了GH3-2蛋白的IAA-Asp合成酶活性。激素含量测定结果表明,GH3-2超量表达植株和野生型对照牡丹江8在接种白叶枯病菌、细条病菌或稻瘟病菌后,野生型的IAA含量均比GH3-2超量表达植株的上升得多。利用定量RT-PCR技术确定了两个IAA合成途径上的酶NIT1和AA03在分别接种白叶枯病菌,稻瘟病菌和细条病菌后的材料中均被诱导上升表达,且感病材料的上升更强烈,说明接种后植株的IAA含量的上升是由于上调IAA合成途径而引起的。用外源IAA处理植株,再分别接种细条病菌RH3和稻瘟病菌CHL358,结果表明IAA可以增强水稻对细条病菌RH3和稻瘟病菌CHL358的感病性,说明IAA在病程反应中扮演毒力因子的作用。通过测定白叶枯菌株PXO61、PXO99和PXO347,细条病菌株RH3以及稻瘟病菌株CHL358和RB11分泌到培养基的激素的实验表明,在这些菌株的培养基分泌物中的确存在植物激素IAA,这一结果更加表明病原菌可能利用IAA作为侵染植物过程中的毒力因子,IAA负调控水稻的抗病反应。综上所述,GH3-2通过失活IAA下调生长素信号途径来赋予水稻广谱的抗性。
黄青云[5]2006年在《水稻细菌性条斑病侵染水稻明恢63诱导差异蛋白质组学研究》文中提出水稻细菌性条斑病(简称细条病),广泛分布于华南、中南稻区。该病是细条病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Xooc)引起的一种细菌性病害,于20世纪50年代在我国广东省首先发现,后因感病的杂交水稻大面积推广,致使此病迅速蔓延,病区不断扩大,已成为我国水稻主要病害和重要的检疫对象。目前国内外对于水稻细条病的研究仅仅限于基因组学的研究以及抗性基因的转化,而对该病菌侵染水稻后诱导机体蛋白应答的系统性研究还未见报导。因此,运用差异蛋白质组学手段开展水稻对细条病菌侵染的应答相关蛋白研究,无论是在阐明水稻的抗性分子机理和基因表达调控方面,还是在高产、优质、高抗的水稻品种的分子育种方面具有重要意义。本试验以水稻品种“明恢63”和强毒力细条病菌株“89773-1-1”为供试材料,在水稻主茎六叶一心期时,提取叶片全蛋白运用双向凝胶电泳分离,研究了叶片在接菌处理和不接菌的对照条件下不同时期蛋白质组差异表达谱,质谱分析鉴定差异蛋白质,通过对差异表达蛋白质的分析,探讨水稻对细条病菌侵染的防卫应答系统。在细菌侵染后2 h、5 h、12 h、48 h 4个处理时间梯度进行取样,提取叶片全蛋白样品,通过双向电泳-质谱技术,比较其蛋白质表达情况。结果发现,共有33个蛋白质点在不同侵染时期发生了差异表达,其中表达量上升的有21个;表达量下降的有12个。经MALDI-TOF/MS检测及肽指纹图谱(PMF)分析,其中27个蛋白点在有关数据库中得到了归属鉴定。进一步对这27个蛋白及其特性进行综合分析,认为这些蛋白参与了水稻对细条病侵染的信号识别及防卫应答,其中包括信号转导类蛋白、防卫相关蛋白、代谢相关蛋白和参与蛋白质合成的蛋白等。结果表明,中感水稻品种“明恢63”对细条病病菌侵染后的生物应答受复杂的网络调控机制控制。这些功能蛋白的鉴定为探明水稻对细条病的抗性机理,明确细条病菌与寄主植物水稻相互作用的分子基础及其抗病信号转导途径及寻找与抗细条病菌密切相关的差异表达蛋白质和基因奠定了基础。
韩庆典[6]2008年在《水稻细菌性条斑病抗性QTL qBlsr5a的精细定位及候选基因的表达分析》文中指出水稻细菌性条斑病(Xanthomonas campestris pv.Oryzicola),简称水稻细条病,是水稻上一种重要的检疫性细菌病害。该病主要危害水稻叶片,水稻受侵染后,叶片变黄甚至枯死,空秕粒增多,千粒重降低,一般可减产10%～20%,严重时达40%。目前,细条病已成为南方稻区的主要病害,成为影响水稻产量及品质的重要限制因子。相对于水稻另两大病害(白叶枯病和稻瘟病),水稻对细条病的抗性属于典型的数量性状,不存在主基因抗性,现有种质资源中也未发现对该病表现免疫的品种。因此,深入挖掘现有资源中的数量抗性基因座(Quantitative resistance locus,QRL),不仅具有重要的实践应用价值,而且可以对数量抗病性的机制研究提供帮助。目前,在水稻中已报道13个细条病抗性QTL,其中Tang等以高抗细条病品种Acc8558和高感细条病品种H359为亲本构建的重组自交系群体,定位了11个细条病抗性QTL,其中位于5号染色体短臂上的QTL qBlsr5a(其抗病等位基因来自抗病亲本Acc8558)对表型变异贡献率最大,并在后续研究中得到了证实。这说明qBlsr5a在水稻细条病抗性的遗传改良上具有较大的应用前景。本研究在前人工作的基础上,对qBlsr5a进行更深入的研究。分别以Acc8558和H359为供体亲本和受体亲本,通过回交和分子标记辅助选择,育成了只渗入供体5号染色体短臂含抗性QTL qBlsr5a的区段的近等基因系H359-BLSR5a。进一步将该近等基因系与H359杂交,建立了一个大的F2群体(2,265单株)。采用选择极端表型个体并验证其后代(F_(2:3))株系的方法,在F_2群体中鉴定出目标QTL为抗病纯合基因型的个体。通过对这些个体进行分子标记基因型检测和连锁分析,将qBlsr5a定位在SSR标记RMl53和RM159之间,大约2.4 cM或290 kb的范围内。利用Affymetrix的基因芯片对抗病品种Acc8558和感病品种H359中受细条病菌侵染调控的基因进行高通量的检测。在两品种中共检测到956个差异表达基因,其中12个基因在两品种中一致上调,54个基因在两品种中一致下调,20个基因在两品种中表达变化方向相反。对差异表达基因的基因本性(GO)、代谢路径和启动子进行了分析。比较所有差异基因与已报道的13个抗性QTL的位置关系,发现有30个差异表达基因的位置与这些抗性QTL吻合,但在qBlsr5a的定位区间(290 kb)内只检测到一个差异表达基因(LOC Os05g01330),且功能未知。在水稻Gramene(http://www.gramene.org/Oryza_sativa_japonica/contigview)及TIGR(http://www.tigr.org/tdb/e2kl/osal/GO.retrieval.shtml)数据库中查询,发现qBlsr5a的精细定位区间(290 kb)内共有51个预测基因,其中33个(64.7%)有功能注释。根据这些功能注释,我们选择了19个预测基因(包括那个基因芯片检测到的差异表达基因)进行表达分析,其中3个预测编码多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白前体(PGIP);1个编码锚蛋白1(ankyrin-1);1个编码转录因子ⅡAγ基(TFⅡAγ);1个编码与K蛋白1互作的锌指蛋白(ZIK1);还有2个含锌指结构。以H359和H359-BLSR5a为材料,在病原菌接种后的不同时期对这19个基因进行半定量RT-PCR分析。结果表明,有4个预测基因在两品系中都没有表达,7个预测基因在两品系中在病菌侵染前后表达都没有变化,其余8个预测基因对病原菌侵染有反应。其中6个基因的表达趋势在两品种中基本一致(5个表达上调,1个表达下调)。1个基因(LOC_Os05g01380)在H359中接种前后没有变化,但在近等基因系H359-BLSR5a中接种6h时表达量开始增强,到24h时表达量达最到高。最令人感兴趣的是预测基因LOC_Os05g01444,它在H359中没有表达,而在H359-BLSR5a中被诱导表达,且在接种6h时表达量达到最高。该基因编码区长度为1,206 bp,无内含子,预测编码多聚半乳糖醛酸酶抑制前体蛋白(PGIP),已知PGIP参与植物的多种抗病反应。因此看来,该基因是qBlsr5a的一个重要的候选基因。
郑伟[7]2008年在《水稻白叶枯病菌遗传多样性分析》文中认为本研究利用国内外广泛应用的几种IS-PCR和Rep-PCR引物、利用已知无毒基因序列自行设计引物、以及利用几个与无毒基因相关片段为探针研究中国、日本和菲律宾水稻白叶枯病菌的遗传多样性与致病性之间的关系。首先以J3,IS1112,IS1113和ERIC为引物对来自中国、日本和菲律宾的水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)进行遗传多样性分析。对114个参试菌系的PCR扩增结果表明,参试菌系表现出地域性差异。以70%为簇界,对4种引物扩增结果进行UPGMA综合聚类,叁个国家的菌系共分6个分子簇,1簇菌(60.5%)是叁个国家菌系的主要分子簇,说明大多数参试菌系之间的遗传关系密切。对17组56株中国、日本和菲律宾的水稻白叶枯病菌母株和它们的单细胞系的研究结果表明:ⅰ)母株与单细胞系属于同一分子谱型的比率依次为:52.9%(J3)、23.5%(IS1112)、29.4%(IS1113)和35.3%(ERIC);ⅱ)综合4个引物的PCR扩增结果,采用UPGMA聚类,母株与单细胞系完全相同的,只有1组;以带位相似率70%为簇界,参试菌可以划分为7簇,来自中国、日本和菲律宾的12个组的母株和单细胞系聚合在同一簇中,占参试菌的70.6%,说明叁个国家病菌的母株和单细胞系在遗传上存在高度相关性;但叁个国家的病菌的母株与其单细胞系之间也存在簇群差异,如Pxo79组的母株和单细胞系各分在不同的3簇中,Pxo79,Pxo86,Pxo99和Pxo112等菌系的母株和单细胞之间的差异率达到了41%;ⅲ)致病性测定结果表明,中国、日本和菲律宾菌系的病原型分化明显,菌系之间存在有明显的致病性差异。同时参试的17组56个菌系的致病性测定结果表明,只有2组的母株和单细胞系的毒力相同,占11.8%。其余15组的母株和单细胞系的毒力存在致病性差异。其次,利用已知的水稻白叶枯病菌无毒基因以及致病相关基因序列,开展水稻白叶枯病菌株的毒力分化研究,获得如下结果:3个HXA引物(HXA-9,HXA-14,HXA-15),对19个来自中国、日本和菲律宾水稻白叶枯病菌系的基因组DNA进行PCR分析。结果表明这19个参试菌株的基因组中都含有与我们引物设计所利用的无毒基因相关的同源片段。同时结果也表明利用小片段的无毒基因中的保守序列设计的引物,不能有效的区分菌株,而利用无毒基因的大片段设计的引物可以较好的区分不同国度的菌株。用3种不同的内切酶(EcoRⅠ,XhoⅠ和HindⅢ)消化,以avrXa10和avrXa10中心区域,以及回收片段HXA-14-3、HXA-15-3、HXA-15-2和HXA-15-0.7等6个片段为探针,研究19个来自中国、日本和菲律宾水稻白叶枯病菌系的基因组DNA,对获得RFLP指纹谱型进行分析。从RFLP谱型和UPGMA聚类分析结果来看,EcoRⅠ酶切,HXA14-3为探针的组合的结果最有代表性。但是本试验中参试菌系的PCR检测结果、RFLP结果和聚类分析结果均未发现与病原菌的致病性之间具有相关性。
郭亚辉, 许志刚[8]2006年在《水稻条斑病菌致病力分化研究进展》文中提出比较了过去40年中国内外水稻条斑病菌致病力分化研究成果,结果表明:传统研究方法和分子植物病理学研究方法的结论是一致的,即品种与病菌的互作反应以弱互作为主,部分菌株与品种间存在强互作关系。提出了优先选用既抗白叶枯病又抗条斑病双抗源材料的建议,以期为水稻细条病的深入研究提供参考。
许美容[9]2011年在《非寄主抗性基因介导水稻抗细菌性条斑病的分子机理及水稻抗白叶枯病材料的筛选和QTL定位》文中提出由Xanthomonas.oryzae pv. oryzicola(Xoc)引起的细菌性条斑病和由X. oryzae pv. oryzae(Xoo)引起的白叶枯病是水稻生产中危害严重的两种细菌性病害。白叶枯病菌与水稻抗病基因之间存在典型的特异性互作,培育和种植抗病品种是防治水稻白叶枯病最有效手段之一。Xoc与Xoo亲缘关系相近,但是水稻在细菌性条斑病抗性改良方面进展缓慢,其主要原因是水稻对Xoc的抗性由多基因控制。随着分子生物学技术的发展,利用非寄主抗性基因可能是培育广谱持久抗病品种的新途径。本研究一方面利用农杆菌介导法将从玉米中克隆的细菌性条斑病非寄主抗性基因Rxo1导入到水稻中,采用全基因组芯片和RT-PCR等方法分析了转基因水稻株系抗细菌性条斑病的分子机理;另一方面采用Xoo代表菌株人工接种水稻回交群体,筛选抗白叶枯病水稻株系,定位数量抗性座位(QTL)。主要研究结果如下:1.携带非寄主抗性基因Rxo1的转基因植株接种Xoc后产生典型的HR表型。组织学分析发现转基因植株的叶片接种后木质素、胼胝质和酚类等基础抗病物质积累增加;过氧化物酶和β-1,3葡聚糖酶等酶类的活性提高。2.利用Affymetrix全基因组芯片,分析Rxo1转基因植株(9804-Rxo1)及其受体(9804)接种Xoc后基因表达谱,鉴定了可能参与抗病反应的主要基因。结果表明接种后36h,在9804-Rxo1和9804中分别有175个和379个基因差异表达,其中175个( Differentially expressed gemes, DRGs)中92.00%的为上调,且多达48.22%的DRGs为防御反应相关基因。在转基因植株中过氧化物酶(Peroxidase, POD)、脂氧合酶(lipoxygenase 2.1, LOX)、病原相关蛋白和萜烯合酶家族蛋白以及C2H2、WRKY与myb类转录因子接种后诱导表达。接种后48h,9804-Rxo1和9804的DRGs分别为2450和1950个,其中HR和SA、ET信号传导途径的关键基因在转基因植株中显着差异表达;SAPK和PPR家族的基因、WRKY和MYB转录因子可能参与抗病反应。3.分析了SAPK家族基因在携带寄主R基因和非寄主R基因水稻株系中的表达谱。携带Rxo1的植株接种Xoc后,4个SAPK上调表达,其中SAPK9快速持续地高水平表达;携带白叶枯抗病基因Xa23的植株接种Xoo后,4个SAPK被诱导表达。此外,抗性株系接种后内源ABA水平上升;结合蛋白质序列分析,推测motif 6 (GM[DE]MPIMHD[GS]DR)和/或motif 7 (IN[QH][FI]L[TN]D[GS]LDDDM)可能与ABA反应相关。4.用8个非目标性状优良的水稻回交群体,人工接种14个Xoo代表菌株,筛选获得23个广谱抗性株系;定位到了65个白叶枯病各小种抗性相关的QTL(包括13个主效QTL),有25个标记至少在3个不同的群体或同一群体的不同菌株环境下被定位到;这25个标记中有9个等位基因的抗性来源于轮回亲本HHZ(加性效应为正);另9个的抗性来源于各供体,其余的7个标记的抗性来源因菌株而异。本研究从分子水平证明了非寄主抗性基因可以在异种植物中介导HR反应,暗示寄主抗病基因和非寄主抗性基因可能有部分相同的抗病分子机制,为深入研究非寄主抗性基因抗病机理提供了理论基础;同时筛选到的广谱抗白叶枯病材料和定位到的主效QTL将为通过分子育种手段改良水稻品种的白叶枯病抗性提供基础材料。
陈功友[10]2000年在《水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）hrp基因克隆与特性研究》文中提出如同其它革兰氏阴性植物病原细菌一样，水稻上两种重要的病原细菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae（简称Xoo）and pv.oryzicola（简称Xooc））也拥有hrp基因。hrp基因决定着植物病原细菌在非寄主植物上激发过敏反应（hypersensitive response，HR）和在感病寄主植物上致病（pathogenicity）的能力。hrp基因还编码组成Ⅲ型泌出系统的蛋白并将效应分子转运至寄主细胞中。harpin是激发非寄主产生HR的蛋白类信号分子。hrp基因发生突变，则丧失上述功能。 本研究用硫酸二乙酯（DES）化学诱变Xoo野生菌株JXOⅢ和PXO99~A及Xooc野生菌株RS105，获得26株叁种类型的hrp~-突变体：HR~-/Pth~-/harpin~-，HR~-/Pth~-/Ⅲ~-和HR~-/Pth~±/harpin~-；4株dsp~-突变体。dsp~-突变体丧失致病功能但胞外多糖能够正常产生。野生型菌株和部分hrp~-突变体经细胞超声波破碎和10％水饱和酚法验证，脂多糖LPS不是激发烟草产生HR的信号物质。激发HR的信号物质为蛋白类，其对热稳定，对蛋白酶K敏感。hrp~-突变体的胞外水解酶类（淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶和脂酶）活性与野生型菌株相比没有显着差异。hrp~-突变体在hrp诱导培养基上产生的胞外蛋白数目不等。 以E.coli S17-1为宿主菌，以pUFR034为载体而构建的JXOⅢ和RS105基因文库，交叉互补法导入受体菌M55（Xooc hrp~-突变体）中，获得来自JXOⅢ的hrp基因阳性克隆pUHRX245和来自RS105的pUHRS130、pUHRS138和pUHRS662。经酶切和亚克隆分析发现，pUHRX245所携hrp基因片段大小为36.8-kb，pUHRS130、pUHRS138和pUHRS662所携hrp基因片段大小都为39.3-kb，酶切位点相同。在此基础上，构建了36.8-kb和39.3-kb hrp基因片段的限制性酶切图谱。pUHRX245和pUHRS138不仅能功能互补所有的hrp~-突变体恢复激发烟草产生HR，而且可使hrp~-突变体M1005恢复致病性，表型为细 初 耍条斑病症状。 来自pUHAIQ45的36．SAn hrp基因片段，经一系列亚克隆，获得了3．3协Sacl功能片段，能使所有的h件突变体可在烟草上激发HR（来自PXOg吵的帅－突变体M16除外人序列测定结果表明，3．3－kb DNA片段中含完整的bpc基因，另外还含有与热激蛋白卯家族有关的基因卿OAN和仰ON。HSpOKF和恤OM的功能还不清楚。据推测，可能与感应环境温度和植物信号分子有关。 来自 pUHRS138的 39．3七b hrp基因片段，经一系列亚克隆，获得 4．M’bM’bB删dL闷吐功能片段，能功能互补所有的h叶突变体恢复在烟草上激发HR。：序列测定结果表明，4．5－o DNA片段中含有完整 h叭和 h恤C基因。 交叉功能互补研究表明，来自 XoO的 h咖可交叉互补 XOOC h矿突变体，而来自XooC的hrp“和h恤OC不能单独起作用。 h冲渝o和h…地co序列比较发现，与形成a一螺旋一转一a一螺旋有关的序列高度保守。这一基序的上游，在3862位点和273毛94位点，m户h比和坏林OO有所不同。 根据来自 PXO86的 bed。和来自大豆斑疹病菌（XCpV poed）的 hrof基因序列，PCR方法可从仰基因克隆p和pUHRS138以及XOO、Xe中扩增出h叭和hind同源片段，大小与h叭和bud相同。h叭的序列与bed。相同。PCR的扩增结果还显示，bed。在测试的黄单胞茵中较为保守，hrall在测试的植物病原细菌中较为保守。这说明，pUHRX25和 pUHRS138所携hrp基因片段，不仅含有hrp调控基因hrpG和切和乙而且还含有hrp基因簇的帅基因。：
参考文献：
[1]. 水稻细条病菌毒力分化及遗传多样性研究[D]. 刘友勋. 华中农业大学. 2003
[2]. 中国、日本、菲律宾水稻白叶枯菌致病性和遗传多样性分析及文库克隆pA254的功能研究[D]. 张桂英. 南京农业大学. 2009
[3]. 水稻对细菌性条斑病菌侵染反应的分子机理研究[D]. 曾建敏. 福建农林大学. 2003
[4]. 抑制病原菌诱导的生长素的积累赋予水稻广谱抗性[D]. 傅晶. 华中农业大学. 2010
[5]. 水稻细菌性条斑病侵染水稻明恢63诱导差异蛋白质组学研究[D]. 黄青云. 厦门大学. 2006
[6]. 水稻细菌性条斑病抗性QTL qBlsr5a的精细定位及候选基因的表达分析[D]. 韩庆典. 福建农林大学. 2008
[7]. 水稻白叶枯病菌遗传多样性分析[D]. 郑伟. 华中农业大学. 2008
[8]. 水稻条斑病菌致病力分化研究进展[J]. 郭亚辉, 许志刚. 安徽农业科学. 2006
[9]. 非寄主抗性基因介导水稻抗细菌性条斑病的分子机理及水稻抗白叶枯病材料的筛选和QTL定位[D]. 许美容. 中国农业科学院. 2011
[10]. 水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）hrp基因克隆与特性研究[D]. 陈功友. 南京农业大学. 2000
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