张炬红[1]2003年在《转抗虫基因741杨的抗虫规律性及抗虫机理研究》文中研究说明采用群体和单体饲养的方法，研究了转抗虫基因741杨对舞毒蛾、美国白蛾、和杨扇舟蛾幼虫的抗性规律，同时测定了其对幼虫解毒酶和乙酰胆碱酯酶的影响，并对幼虫的中肠进行了显微观察，观察抗虫毒素对幼虫中肠消化系统的影响，从生理的角度验证转双抗虫基因741杨的抗虫性。 (1)转抗虫基因741杨抗虫规律。转抗虫基因741杨对杨扇舟蛾、舞毒蛾、美国白蛾幼虫有一定的致死作用，尤其是低龄幼虫，对高龄幼虫的致死作用比较弱，但可以抑制存活幼虫的生长发育，主要表现为：幼虫的发育速率、体重增加速率明显降低；排粪量减少；发育历期延长。不同系号的转抗虫基因741杨的抗性不同，其中Pb11和Pb29的抗性较强，Pb12的较弱；转抗虫基因741杨对不同龄期幼虫的抗性不同，对低龄幼虫的抗性较强，随着幼虫虫龄的增加，幼虫本身的抗性增强，抗虫杨对幼虫的致死作用减弱；另一方面，抗虫杨对从不同龄期开始取食其叶片的同一龄期幼虫的抗性不同，取食抗虫杨叶片时间长的幼虫受到的抑制作用比较明显。转抗虫基因741杨对幼虫的抗性具有时空变化规律，不同叶位和展叶时间叶片对幼虫的抗性不同。转抗虫基因741杨的抗虫性具有持续性，可以影响下一代幼虫的生长发育，连续两代取食抗虫杨叶片的幼虫死亡率高于仅上一代取食抗虫杨叶片的幼虫，而且存活幼虫的生长发育受到的抑制作用比较明显；同时，上一代取食抗虫杨叶片而下一代取食Ck的幼虫死亡率也高于两代都取食Ck的幼虫；不同温度下饲养的幼虫死亡率不同，发育速率和体重增加速率、排粪量受的抑制程度不同。 (2)测试昆虫幼虫水解酶——羧酸酯酶、谷胱甘肽—S—芳基转移酶和乙酰胆碱酯酶的比活力受到明显的抑制，用抗虫杨叶片饲养的幼虫，以上叁种酶的比活力远远低于用Ck饲养的幼虫，说明抗虫杨的抗虫毒素使幼虫消化不良，神经传导中断，导致幼虫的不良发育，甚至死亡。 (3)测试昆虫中肠的显微观察。转抗虫基因741杨对幼虫的中肠有明显的影响，导致幼虫中肠细胞变形，细胞之间界限模糊；细胞核难以看见；细胞质上出现空泡，空泡数量和位置异常，严重者出现溃烂现象。
裴婷婷[2]2013年在《LH04-8杨再生体系优化及转抗虫基因Cry1C+Cry9C的研究》文中进行了进一步梳理本研究选用LH04-8杨为试验材料,通过筛选基本培养基、调整相关激素的浓度和调整培养条件等对LH04-8杨的再生体系进行了优化,为后期的遗传转化试验提供了稳定的受体系统。同时,通过根癌农杆菌介导法,探讨了不同影响因子对LH04-8杨抗虫基因Cry1C+Cry9C转化效率的影响,获得了抗性植株。本研究获得的主要结果如下：1.LH04-8杨无性系高频组培再生体系的建立。(1)LH04-8杨茎段、叶柄和叶片采用二次消毒法：用70%酒精处理20s,再用0.1%HgC12进行消毒处理,具体处理时间如下：①基地直接采摘的外植体：茎段10min,叶柄8min,叶片6min;②水培萌芽后得到外植体：茎段6min,叶柄5min,叶片3min;(2)在筛选基本培养基的基础上,探究了不同组合及浓度的植物生长剂对LH04-8杨组织培养苗离体再生的影响。获得了高效、稳定的再生体系,研究表明,叶片分化的适宜培养基为MS+4.0mg/LBA+0.2mg/LNAA+0.005 mg/LTDZ,其分化率达86.66%,且单个叶片分化丛生芽较多。2.以LH04-8杨的再生苗叶片作为其抗虫基因转化的受体材料,建立了高效、稳定的遗传转化体系。(1)本试验选择头孢霉素(Cef)作为农杆菌EHA105的抑菌抗生素。叶片转化筛选培养阶段Cef的适宜浓度为200mg/L,卡那霉素(Kan)适宜浓度为20mg/L；不定芽生根培养阶段,Cef的适宜浓度为100mg/L, Kan的适宜浓度为10mg/L。(2)利用农杆菌介导法介导抗虫基因Cry1C+Cry9C的转化。对影响LH04-8杨遗传转化的预培养时间、侵染条件和筛选方式等各因子进行研究,试验最终获得的转化条件为：先将叶片接种于分化培养基中预培养3d,然后将叶片取出使用OD600值为0.8的菌液浸泡10min,共培养3d,延迟筛选时间为15d,在此转化体系下,其抗性芽获得率较高,达17.78%。(3)抗性植株在含抗生素的培养基上能正常分化、生根,本试验对获得的7株Kan抗性植株进行PCR检测,结果表明有4株的DNA样品呈阳性,初步证明目的基因Cry1C+Cry9C已经被导入LH04-8杨的基因组中。(4)移栽成活1株PCR检测呈阳性的LH04-8杨转基因植株。
杜娟[3]2006年在《外源基因在转基因杨树世代传递间遗传及表达规律研究》文中认为本试验选用具有不同抗虫性的转双抗虫基因(Bt和API)741杨株系为母本,用具有优良特性的白杨无性系84K杨为父本,进行有性杂交,获得杂种后代家系。以不同杂种家系为材料,对外源基因(标记基因NptⅡ和BtCrylAc基因)的遗传和表达及外源基因间的相互关系进行研究。探索外源基因遗传和表达的规律性与稳定性,外源基因间在遗传和表达上的相互关系,为转基因杨树的利用和杂交育种提供理论依据和原始材料。取得的进展如下: 1.通过对741杨和毛白杨成龄大树进行5a结实性研究结果表明:741杨果穗长度、果穗粗度、果穗数量、每个果穗蒴果数均显着低于毛白杨的。毛白杨果穗在成熟开裂前5-10%脱落,而741杨70-90%脱落,因此741杨不会造成明显的飞絮现象,且减少了外源基因飘移的可能性。 转基因741杨较难获得种子,其原因主要是杂种胚发育到3周以后停止发育并消失,导致果穗结实率低,且大部分果穗成熟前脱落。因此采用胚挽救是克服杂交不育的一种有效的方法。通过试验确定较适杂种苗幼胚培养的培养基为MS+6-BA0.1mg/L。 2.试验研究发现杨树抗性芽在含50mg/LKan生根培养基中生根是很好的筛选过程,一般通过嫩茎小植株在50mg/LKan生根状况,即可初步断定杂交后代中是否含有新霉素磷酸转移酶基因NptⅡ。5个杂交组合产生的后代中选取41个生长势较好的杂种单株进行了Kan生根筛选,试验结果表明:所选41个单株不符合一对等位基因的孟德尔分离规律;同理在杂交组合PB1×84K中产生的后代中,符合一对等位基因的孟德尔分离规律;在PB6×84K中产生的后代中,不符合一对等位基因的孟德尔分离规律,由于其余3个杂交组合群体较小没有进一步验证。由于本试验总的群体较小,试验的准确性有待进一步验证。 3.本试验以转双抗虫基因741杨的5个株系为母本,未转基因的84K为父本,杂交F_1代获得的73个单株为研究对象,利用PCR技术检测分析了BtCry Ⅰ Ac和Npt Ⅱ基因的表达及遗传。结果表明:检测的杂交F_1代单株中,外源基因BtCry Ⅰ Ac分离比例为1.70:1,经X~2测验不符合一对等位基因的孟德尔分离规律;在转基因株系PB1杂交F_1代中分离比例为1∶1,经X~2测验符合一对等位基因的孟德尔分离规律;在转基因株系PB6杂交F_1代中分离比例为2.43∶1,经X~2测验不符合一对等位基因的孟德尔分离规律。 同理,研究NptⅡ基因的分离,杂交F_1代73个单株中外源基因NptⅡ分离比例为1.92∶1,经X~2测验不符合一对等位基因的孟德尔分离规律;在转基因株系PB1杂交F_1代中分离比例为1∶1,经X~2测验符合一对等位基因的孟德尔分离规律;在转基因株系PB6杂交F_1代中分离比例为3.8∶1,经X~2测验不符合一对等位基因的孟德尔分离规律。两个外源基因在PB6×84K杂交F_1代不符合1∶1的分离规律,接近3∶1
范海娟[4]2005年在《转双元基因单倍体小黑杨的抗虫性研究》文中研究表明为探索转Bt+蜘蛛杀虫肽基因单倍体小黑杨(Populus simonii Carr.×P.nigra L.)的抗虫性,本研究以两个转基因无性系TT1、TT3植株为测试对象,以未转基因的单倍体小黑杨植株为对照,采用叶片离体饲养和树上套笼饲养法测定了转基因株系对舞毒蛾Lymantria dispar(Linnaeus)、天幕毛虫Malacosoma neustria testacea Motschulsky、杨扇舟蛾Clostera anachoreta(Fabricius)的抗性,并采用石蜡切片技术分析了转基因株系所表达杀虫蛋白对杨扇舟蛾幼虫中肠结构的影响,以期为转抗虫基因株系的扩繁和商品化生产提供科学依据。 本论文的研究结果如下: (1)转基因植株有增加幼虫死亡率的作用。从校正死亡率上看,对舞毒蛾,TT1作用强于TT3,第20～24d作用明显;对天幕毛虫,TT3作用强于TT1,第12～18d作用明显;对杨扇舟蛾,TT3作用也强于TT1,第1～15d作用明显。 (2)转基因植株能抑制幼虫蜕皮并表现一定的毒力。对于舞毒蛾,在第18d之前TT3的毒力大于TT1,第24d时TT1毒力大于TT3;对于天幕毛虫和杨扇舟蛾,TT3的毒力均大于TT1;TT1和TT3对叁种幼虫的毒力随时间有较大起伏,无明显规律性。 (3)转基因植株能延缓幼虫发育,从总的发育历期看,TT3的延缓作用大于TT1。对于舞毒蛾的各龄幼虫,TT1与TT3的延缓作用随龄级变化而波动,对天幕毛虫、杨扇舟蛾的各龄幼虫,TT3的延缓作用大于TT1。 (4)转基因植株能抑制幼虫体重增长,从总体上讲,随时间延长其作用更明显。在平均体重上,对舞毒蛾的影响TT1和TT3差别不大,对天幕毛虫,TT3的抑制程度明显大于TT1;在体重增加量和增加速率上,TI1和TT3对舞毒蛾、天幕毛虫的抑制均前期TT3效果好,后期TT1效果好。 (5)转基因植株能降低幼虫取食量和排粪量,TT3的作用大于TT1。 (6)转基因植株具有一定的影响幼虫取食行为的作用,并使死亡幼虫表现一定的症状。取食转基因植株的天幕毛虫和杨扇舟蛾幼虫死亡后多体色发暗,虫体直而肿胀。 (7)转基因植株具有降低蛹重、致蛹畸形的作用。取食转基因植株的幼虫所化的蛹明显小于对照的蛹,蛹的均重明显低于对照蛹,取食TT3的幼虫还出现了畸形蛹。 (8)转基因植株具有破坏幼虫中肠的作用。随时间的延长,取食同一转基因无性系植株的幼虫中肠细胞排列的紧密程度、细胞形状的规则性下降,细胞逐渐变形、解体,幼虫肠腔内容物含量减少,整个中肠最后甚至完全变形,肠腔内无任何食物。两个转基因无性系相比,TT3对幼虫中肠的破坏作用强于TT1。
遇文婧[5]2009年在《欧美杨108号遗传转化条件筛选及抗虫性测定》文中研究指明杨树种类多、生长快、适应性强,在我国分布广泛并大面积种植,在林业生产和生态恢复中发挥着巨大的经济效益和生态功能。由于人工林面积的逐年增加和经营管理不当,长期遭受病虫的侵害,造成严重的经济和生态损失。本文以欧美杨108号(Populusnigra×Populus deltoids“108”)为受体材料,采用农杆菌介导法,在优化的转化条件下将外源抗虫基因(Bt+蜘蛛杀虫肽基因)成功导入该受体中,并对转化植株进行分子和生物测定,确定欧美杨108号转化植株的的表达效果、抗性水平,为抗虫杨树的定向培育和野外应用奠定科学基础。1.对欧美杨108号遗传转化条件优化后,确定最佳转化体系为选择欧美杨108号无菌苗叶基部置于不含卡那霉素、含200μmol/L AS的分化培养基中,预培养48h后用浓度OD_(600)=0.1的菌液侵染10min,移入不含卡那霉素、含200μmol/L AS的分化培养基中,28℃共培养24h～48h后,取出置于温室中除菌筛选培养,最终获得抗性植株。2.以上述最佳转化条件为基础,进行了遗传转化,获得卡那霉素抗性芽5株。经过PCR检测4株呈阳性,初步表明其目的基因已转化到欧美杨108号基因组中。经过PCR-Southern印迹杂交检测,4株均呈阳性,阳性率100%,进一步证明,目的基因已整合到欧美杨108号基因组内。3.利用转化植株对舞毒蛾幼虫进行了生物测定,结果表明,2个转化植株均具有延缓幼虫发育和降低发育速率的作用,而且转化植株TP_1对幼虫发育速率的影响明显大于TP_2。4.转基因植株对舞毒蛾幼虫体重增长具有抑制作用,且表现出抑制作用随时间延长而增强的趋势,前期抑制作用较强,中期稍有下降,但后期又缓慢上升;TP_1和TP_2对幼虫体重降低率的抑制作用差异并不显着。转基因植株与舞毒蛾幼虫取食量和排粪量关系发现,转基因植株具有减少幼虫取食量和排粪量的作用。5.对转化植株进行抗虫性初步检测表明,转化植株具有明显的杀虫效果,TP_1导致舞毒蛾幼虫的死亡率高于TP_2。
参考文献：
[1]. 转抗虫基因741杨的抗虫规律性及抗虫机理研究[D]. 张炬红. 河北农业大学. 2003
[2]. LH04-8杨再生体系优化及转抗虫基因Cry1C+Cry9C的研究[D]. 裴婷婷. 华中农业大学. 2013
[3]. 外源基因在转基因杨树世代传递间遗传及表达规律研究[D]. 杜娟. 河北农业大学. 2006
[4]. 转双元基因单倍体小黑杨的抗虫性研究[D]. 范海娟. 东北林业大学. 2005
[5]. 欧美杨108号遗传转化条件筛选及抗虫性测定[D]. 遇文婧. 东北林业大学. 2009