C4orf22基因的克隆、表达及功能初步研究

论文摘要

过去的十几年间,在育龄夫妇中出现不育的情况越来越多,约达到10-15%,其中男性约为33.15%,追其原因主要是男性生精功能障碍,症状表现为没有精子或严重缺乏精子。精子的形成是一个复杂的过程,该过程受基因、激素以及环境等多个因素的调控,其中,生精相关基因起着关键的作用。目前,通过实验已经发现许多与精子发生或生精细胞凋亡相关的基因,但仍有许多参与调控精子发育的基因尚未被发现,而发现与睾丸生精细胞的产生、发育或凋亡相关的基因,并研究其功能,对阐明精子发生过程中的生理、病理相关的机制具有重要的意义。本研究,通过数字消减杂交技术（digital differential display,DDD）克隆了一个在睾丸组织中高表达的新基因C4orf22,对该基因mRNA的时空表达谱进行了系统性分析,并对其生物学功能进行了初步研究。生物信息学分析表明小鼠基因C4orf22的cDNA全长为891 bp,定位于小鼠5号染色体的E3-E4区,含有6个外显子和5个内含子,其编码的蛋白质分子量为26.9 kD,含有233个氨基酸。多组织RT-PCR结果表明基因C4orf22的mRNA在性成熟的小鼠睾丸组织中高表达,在肺部组织中弱表达,其它组织未检测到表达。免疫组化分析表明:C4orf22蛋白主要在睾丸组织的精原细胞和精母细胞中表达。构建了pET28b/C4orf22原核表达载体,通过IPTG诱导C4orf22融合蛋白,并采用亲和纯化方法分离纯化了目的蛋白质。在GC-1细胞和GC-2细胞中分别转染pEGFP-C3/C4orf22质粒后,可以观察到绿色荧光均主要出现在胞浆中,表明C4orf22蛋白主要在这两种细胞的胞浆中表达。通过在GC-1细胞中过表达基因C4orf22,并且流式分析细胞周期和细胞凋亡的变化,结果显示:在GC-1细胞中过表达该基因可以明显抑制细胞的凋亡。对细胞凋亡相关的基因Bax,Bcl-2,caspase-3和caspase-8进行qRT-PCR分析,结果显示:抗凋亡基因Bcl-2表达显著增加,促凋亡相关基因Bax,caspase-3和caspase-8表达降低。另一方面,通过在GC-1细胞中干扰该基因的表达,并且流式分析细胞周期和细胞凋亡的变化,结果显示:干扰该基因的表达促进细胞的凋亡。以上实验结果表明新基因C4orf22与生精细胞的发生和凋亡过程有关,其在GC-1细胞中可能通过Bcl-2调节通路来影响生精细胞的凋亡。

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李卉

导师: 聂东宋

关键词: 基因,基因表达,细胞周期,细胞凋亡

来源: 湖南理工学院

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,泌尿科学

单位: 湖南理工学院

分类号: R698.2;Q78

DOI: 10.27906/d.cnki.gnghy.2019.000041

总页数: 79

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标签：基因论文;  基因表达论文;  细胞周期论文;  细胞凋亡论文;