李娟[1]2004年在《重组CFP-10蛋白和CFP10-ESAT6融合蛋白的制备及其诊断应用价值的初步研究》文中研究说明目的 制备重组CFP-10蛋白和CFP10-ESAT6融合蛋白，评价其在结核病血清学诊断和皮试诊断中的应用价值。 方法 PCR扩增得到CFP-10、CFP10-ESAT6基因片断，将其分别克隆入pET-24b和pET-28a表达载体。优化表达条件、纯化重组CFP-10蛋白(rCFP-10)和CFP10-ESAT6蛋白(rCFP10-ESAT6)。建立以rCFP-10、rESAT-6、rCFP10-ESAT6为抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法，检测结核患者血清和健康者血清中的抗体。建立豚鼠13种分枝杆菌致敏模型，PPD及叁种重组蛋白皮肤轮圈试验，注射后24h、48h、72h测量DTH反应纵、横直径(cm)。 结果 重组质粒pET24b-CFP10、pET28a-CFP10-ESAT6靶基因测序结果与预计设计完全一致。两种重组蛋白在Ecoli BL21(DE3)工程菌中均为可溶性表达，表达量分别占菌体总蛋白的20％和40％。利用金属螯合亲和层析直接纯化重组蛋白，纯度达到90％以上。Western blot分析表明，重组蛋白能与结核患者血清发生特异性免疫结合反应，与健康者血清不发生反应。ELISA结果显示：rCFP-10的特异性和敏感度分别为100％和15.1％：rESAT-6分别为97％、18.2％；rCFP10-ESAT6分别为97％、36.4％。叁种重组蛋白均可诱发H_(37)Rv致敏豚鼠的DTH反应，其效力与PPD相似。在卡介苗(BCG)及其他多种分枝杆菌致敏豚鼠体内，诱发DTH反应的能力小于PPD，差别有显着性意义(P＜0.05)。 结论 pET24b-CFP10／BL21(DE3)、pET28a-CFP10-ESAT6／BL21(DE3)工程菌能高效表达CFP-10蛋白和CFP10-ESAT6融合蛋白，该重组蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性，有可能成为结核病免疫学诊断的特异抗原。
李跃峰[2]2013年在《结核杆菌分泌蛋白ESAT6、CFP10对细胞凋亡及免疫影响的初步研究》文中进行了进一步梳理目的结核杆菌属胞内寄生菌，比较基因组学对卡介苗和H37RV进行对比，发现所有卡介苗缺失RD1区。研究发现RD1区存在于所有的致病性结核分枝杆菌，而结核杆菌毒力的强弱与细胞的凋亡成负相关。有假说认为RD1区的分泌蛋白ESAT6和CFP10与细胞的凋亡有关。卡介苗是目前唯一应用的结核病疫苗，但是卡介苗对成人的保护效果低。本试验对分泌蛋白ESAT6、CFP10与细胞的凋亡关系进行研究，并用构建的ESAT6和CFP10真核表达载体分别与卡介苗一起免疫小鼠，检测抗体和IFN-y的变化，为开发新的疫苗提供数据参考。方法：⑴设计ESAT6、CFP10基因的引物，以灭活的结核杆菌H37Rv为模板，用PCR方法扩增得到ESAT6、CFP10基因全长。（2)将ESAT6、CFP10基因与T载体连接，构建克隆载体pGM18-T-ESAT6、pGM18-T-CFP10；双酶切克隆载体pGM18-T-ESAT6、pGM18-T-CFP10后，将ESAT6、CFP10基因分别与pEGFP-Nl真核表达载体连接，构建重组真核表达载体pEGFP-Nl-ESAT6、pEGFP-Nl-CFP10o (3)用pEGFP-Nl-ESAT6、pEGFP-Nl-CFP10重组真核表达载体转染293T细胞，荧光显微镜观察细胞转染结果。用Western Blot方法对细胞蛋白样进行分析。(4)用激光共聚焦显微镜对转染的293T和U937细胞进行定位分析。（5)对转染的293T细胞用流式细胞仪进行凋亡率分析，用荧光实时定量PCR仪进一步对细胞中凋亡相关基因的变化进行分析。(6)将pEGFP-Nl-ESAT6、pEGFP-Nl-CFPIO重组真核表达载体分别与卡介苗一起联合免疫小鼠，检测其血清中的抗体及IFN-y的变化。结果(1)质粒PCR-、双酶切和测序验证表明pEGFP-NlESAT6、pEGFP-Nl-CFP10重组真核表达载体构建成功。（2)pEGFP-Nl-ESAT6、pEGFP-Nl-CFP10重组真核表达载体转染细胞后表达出绿色荧光，Western Blot结果表明ESAT6、CFP10在细胞内正确表达。（3)激光共聚焦显微镜观察结果显示，转染pEGFP-Nl-ESAT6后，绿色荧光主要分布于293T细胞和U937细胞的细胞质；转染pEGFP-Nl-CFP10后，绿色荧光在293T细胞分布于细胞质，而在U937细胞中绿色荧光除在细胞质分布外，也分布于细胞核的部分区域。（4)流式细胞仪分析结果表明转染pEGFP-Nl-ESAT6、pEGFP-Nl-CFP10组细胞凋亡率均上升，用荧光实时定量PCR进一步分析表明，两组细胞中Caspase8基因的相对表达量在12h、24h、48h时有显着上调，Bcl-2基因在48h时相对表达量有显着下调，Caspase3基因的相对表达量在48h时相对表达量有显着上调，Bax、AIF基因在12h、24h、48h时相对表达量变化不显着。（5)pEGFP-Nl-ESAT6> pEGFP-Nl-CFP10分别与卡介苗一起免疫小鼠两次后，结果表明在小鼠血清中未检测到针对ESAT6、CFP10蛋白的抗体，但小鼠血清中IFN-y水平有显着上升。结论(1)获得了结核杆菌ESAT6和CFP10基因的重组真核表达载体pEGFP-Nl-ESAT6> pEGFP-Nl-CFP10。(2) pEGFP-Nl-ESAT6> pEGFP-Nl-CFP10转染293T细胞后，对细胞有促凋亡的作用，其促凋亡作用主要与影响Caspase8、Bcl-2、Caspase3等基因的表达有关。（3) pEGFP-Nl-ESAT6、pEGFP-Nl-CFP10分别与卡介苗一起免疫小鼠后，小鼠体内细胞免疫水平上升。
李红霞[3]2007年在《结核分枝杆菌特异性抗原/抗体ELISA检测试剂盒的初步研究》文中认为结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病，据世界卫生组织(WHO)统计，当前全球约有1／3的人感染了结核杆菌，每年死于结核病的人数达到300万。我国结核杆菌感染率为44.5％，活动性肺结核患者451万，每年死亡人数达13万。结核病成了危害人类健康的重要传染病之一。对结核分枝杆菌的研究再度成为了全球研究的热点。要控制结核病的流行与蔓延的关键在于找到简便、快速、灵敏度高、特异性强的诊断方法。1998年结核分枝杆菌基因组破译成功，运用基因组杂交技术对结核分枝杆菌和卡介苗(BCG)的基因组序列进行比较，发现卡介苗(BCG)相比于结核分枝杆菌，有16个基因差异的区域(Region of Difference，RD)，包括RD1-16，其中的RD1区是仅存在于致病性分枝杆菌包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非洲分枝杆菌及某些非典型分枝杆菌，而不存在于卡介苗(BCG)及其它非致病性分枝杆菌中。RD1区基因所编码的蛋白在结核分枝杆菌疫苗研制开发和检验诊断方面都受到了广泛的关注。CFP10、ESAT6和PPE68的编码基因均存在于RD1区，且具有强烈的免疫原性，因此可将ESAT6、CFP10和PPE68作为诊断结核杆菌感染的特异性试剂。由于单一蛋白在诊断上灵敏度不理想，目前有很多学者认为两个或多个特异性蛋白的联合，有利于提高检测的灵敏度。本研究构建了原核重组质粒pGcfp10、pGesat6、pGcfp10-esat6以及pGesat6-ppe68，经IPTG诱导后在大肠杆菌中高效表达，通过纯化试剂盒获得纯化的重组蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6和ESAT6-PPE68，将叁种纯化蛋白免疫动物，获得了高效价的多克隆抗体血清。以结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)为参考，在建立PPD-ELISA的基础上，建立了以ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被抗原检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA检测方法，旨在为临床结核病的诊断提供敏感性、特异性和实用性都比较理想的诊断试剂，为我国结核病的防治提供技术支持。为了能进一步诊断病人是否为现症感染，本实验建立了以多克隆抗体作为包被抗体检测结核病人血清中特异性抗原的双抗体夹心ELISA检测方法，为结核病的早确诊、早治疗提供了一种新的技术思路。本研究共分五部分进行：第一部分，以结核分枝杆菌H37Rv国际标准株基因组DNA为模板，采用常规PCR法扩增出303 bp的cfp10基因和288 bp的esat6基因，随后将其分别定向连接入原核表达载体pGEX-4T-1，构建原核表达重组质粒pGcfp10和pGesat6，经IPTG诱导，约36kDa的GST-CFP10和约32kDa的GST-ESAT6融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达，并将GST-ESAT6融合蛋白通过谷胱苷肽-S-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化。第二部分，用重迭区扩增基因拼接(GeneSOEing)法扩增cfp10-esat6融合基因，并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，构建原核表达重组质粒pGcfp10-esat6，IPTG诱导表达约42 kDa带GST标签的重组CFP10-ESAT6融合蛋白，经谷胱苷肽-S-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白。第叁部分，采用重迭区扩增基因拼接(GeneSOEing)法实现了结核分枝杆菌esat6及ppe68基因融合，融合基因esat6-ppe68被克隆入原核表达质粒pGEX-4T-1中，构建了原核表达重组质粒pGesat6-ppe68，并使约69 kDa的GST-ESAT6-PPE68融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达，经谷胱苷肽-S-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白。第四部分，将构建的原核表达重组质粒pGesat6、pGcfp10-esat6、pGesat6-ppe68分别在大肠杆菌中经IPTG诱导后大量表达带GST标签的融合蛋白，采用谷胱苷肽-S-转移酶融合蛋白纯化试剂盒获得大量高度纯化的融合蛋白，并将部分纯化蛋白免疫动物，制备高效价的多克隆抗体血清。第五部分，以结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)为包被抗原，通过对血清稀释度、封闭液、底物作用时间及阴阳判定方法等方面的摸索，建立了优化后的PPD-ELISA程序，参考此方法，分别建立了以结核分枝杆菌特异性蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被抗原检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA检测方法。通过与PPD-ELISA进行比较，认为叁种特异性抗体ELISA检测方法在对结核病的诊断上显示了更高的特异性，将特异性抗体ELISA检测方法用于复检PPD-ELISA阳性的病人，将有利于提高结核病诊断的准确性。通过比较叁种特异性抗体ELISA检测方法的特异性与灵敏度，认为两融合蛋白-ELISA的敏感性高于单一蛋白ESAT6-ELISA，两融合蛋白-ELISAZ间的敏感性无差异，但CFP10-ESAT-ELISA的特异性高于ESAT6-PPE68-ELISA，叁种特异性抗体ELISA检测方法以CFP10-ESAT6-ELISA效果最好，PPE68也是很有研究价值的结核特异性诊断抗原。本部分研究还建立了以包被多克隆抗体检测结核特异性抗原的双抗体夹心ELISA方法，经检测发现，叁种方法的灵敏度均较低，分别为12％、18％、19％，但特异性很高，接近100％，认为以结核特异性抗体来检测病人血清中的结核特异性抗原的ELISA检测方法是一种诊断病人是否为结核现症感染的可行的新技术方法。综上所述，检测结核特异性抗体的ELISA方法用于结核病的检测具有敏感性较高，特异性强等优点，可望开发成诊断试剂盒，满足目前临床上结核病诊断的需要，为我国结核病的防治提供技术支持；检测结核特异性抗原的ELISA方法能区别现症感染与既往感染，也能用于结核病治疗的疗效考核，具有很高的研发价值。
戴振华[4]2014年在《结核分枝杆菌抗原定量检测技术的建立及其初步评价》文中认为结核病(TB)仍然是威胁全球人类健康一个重大的挑战。在2012年估计有新增结核病例860万,死于结核病有130万人,其中有30万人为HIV阳性。据估计,全球范围内的结核病发病率和与人类免疫缺陷病毒(HIV)共感染的病例数在未来数十年内将大幅增加。在世界低收入国家的负担较重,特别是在东南亚和撒哈拉以南的非洲。在这些高负担的地区,结核病诊断的基石仍然是痰涂片镜检。在HIV阴性的患者中,常规临床检测敏感性的变化在35%和80%之间,但在艾滋病毒感染的患者中,敏感性低至20%。此外,在后一组中,痰稀缺性是常见的,这就需要增加操作过程,如诱导痰或支气管镜进行样品采集。传统的痰涂片检查在儿童和肺外结核的患者中的用处也有限。分枝杆菌培养需要几个星期才能提供结果,价格昂贵且需要专门的实验室设施,在大多数高负担地区仍无法使用。当前,较新的T细胞定量检测[γ-干扰素的释放试验(IGRAs)]在高负担的地区没有实用性,同时不能区分潜伏的活动性结核病。核酸扩增试验(NAATs)有限的特异性,使之在结核高负担地区无法广泛使用。结核病诊断仍然需要价格低廉,快速,易于推广的检测技术和产品。迄今为止,大多数已开发的方法是基于特定循环抗体的检测。在很长一段时间内,肺结核的血清学诊断一直处于研究阶段,但现在仍然没有一个具有广泛临床应用价值的检测方法。抗原检测几乎可以肯定证实活动性结核的存在。相比之下,抗体检测并不能确定活动性结核,甚至在清除感染半年后也能检测到抗体反应。我们应该集中更多的力量在直接检测体液中抗原的基础上来开发检测方法。这样的检测方法对患者的诊断及治疗过程中的随访可能是有用的。因为在疾病活跃的阶段,结核病具有高度的传染性,对这种疾病快速,特异的检测,不仅可以遏制结核病的蔓延,同时将帮助医生开展恰当、及时的治疗,又可以减少多重耐药(MDR)以及普遍耐药(XDR)结核分枝杆菌菌株进化的机会。1983年,在脑脊液中第一次检测到结核抗原,自此以后陆续有学者在痰液和脑脊液中通过ELISA、乳胶凝集法检测到结核分枝杆菌抗原。近期文献报导则以ELISA和胶体金等检测血清、CSF和尿中的PPD衍生物及其特定的菌体成份,如38kD抗原LAM等,其敏感性和特异性分别在20%-94.0%和78.6%-100%。但这些抗原都比较单一,而且大多数商业抗原检测试剂盒不能满足临床的需要,因此这些结核分枝杆菌抗原的检测方法未能广泛应用于诊断活动性结核病。本研究构建了原核重组质粒pBVIL1-38KD、pBVIL1-ESAT6、 pBVIL1-CFP10,经温度诱导在大肠杆菌中高效表达,用离子交换层析方法纯化蛋白；融合蛋白IL1-38KD+ESAT6+CFP10、GST-38KD+ESAT6+CFP10经温度、IPTG诱导表达后,用离子交换层析、亲和层析方法纯化蛋白。将纯化得到的蛋白免疫动物,获得了高效价的单克隆及多克隆抗体。选用Protein G亲和层析法纯化抗体,同时以纯化得到的抗体分别作为包被抗体和检测抗体建立双抗体夹心检测抗原ELISA法,在此基础上建立了化学发光检测结核分枝杆菌抗原的定量检测技术,并进行初步临床评价。本研究共分五部分进行：1、以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,经过PCR扩增出结核分枝杆菌38KD, ESAT6, CFP10基因。通过分子克隆方法,成功构建结核分枝杆菌38KD、ESAT6、CFP10基因的原核表达质粒pBVIL1-38KD, pBVIL1-ESAT6, pBVIL1-CFP10。通过42℃水浴诱导质粒pBVIL1-38KD, pBVIL1-ESAT6, pBVIL.1-CFP10在原核表达系统中有效表达出约53kDa的IL1-38KD、21.3kDa的IL1-ESAT6、21.1kDa的IL1-CFP10重组蛋白。通过离子交换层析法对IL1-38KD, IL1-ESAT6, IL1-CFP10重组蛋白进行纯化,经间接EILSA法对纯化的蛋白进行了活性的初步鉴定,结果显示克隆表达的蛋白具有很好的灵敏度和特异性。2、本研究是基于实验室成功地构建了pBVIL1-38KD+ESAT6+CFP10、 PGEX-38KD+ESAT6+CFP10质粒的基础上。诱导表达后采用离子交换层析及亲和层析对融合蛋白进行纯化,获得了高浓度、高纯度的融合蛋白。对蛋白的活性进行了鉴定,与各分片段蛋白相比,提高了检测敏感性,并具有很好的特异性。3、将纯化的蛋白免疫大耳白兔,得到了兔抗结核分枝杆菌特异性抗原(38KD、 ESAT6、CFP10和融合抗原38KD+ESAT6+CFP10)的多克隆抗体,效价分别为1：32000,1：16000,1：32000,1：128000。将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,得到了鼠抗结核分枝杆菌特异性抗原的单克隆抗体,抗38kD的阳性克隆共4株：BBA171、BFE624、BBG411、BEA831,抗体滴度效价分别为1：256000、1：128000、1：256000、1：128000；抗ESAT6的阳性克隆1株：BFF1024,抗体滴度效价为1：512000；抗CFP10的阳性克隆1株：BBG1028,抗体滴度效价为1：256000。4、以单克隆、多克隆抗体为包被和标记抗体,创建双抗体夹心结核分枝杆菌抗原ELISA检测法。对试剂各反应条件进行了优化,得到了结核分枝杆菌抗原检测方法的最佳反应条件：包被抗体与酶标抗体分别为兔抗38KD+ESAT6+CFP10多抗与HRP-兔抗38KD+ESAT6+CFP10多抗；包被抗体浓度为0.25ug/ml;样品与稀释液按50ul+50ul稀释；酶标抗体浓度为1：600。同时建立了抗原ELISA法的标准曲线(y=0.0218x+0.1387,R2=0.9933),确定了最低检测限(1.11ng/ml)。在结核分枝杆菌抗原ELISA方法的基础上,建立了结核分枝杆菌抗原化学发光定量的检测方法,标准曲线(y=15583x+89992,R2=0.9962),确定了最低检测限(0.46ng/ml)。5、对建立的结核抗原化学发光定量检测技术进行初步临床评价,对接受抗结核治疗的患者在不同时间段血清中抗原浓度的检测,结果显示患者血清中的结核分枝杆菌特异性抗原会随着治疗时间而逐渐降低。经过对结核患者痰结核分枝杆菌培养上清中结核特异性抗原的检测结果,抗原化学发光技术与结核分枝杆菌培养阳性的符合率较高为92%,同时在结核分枝杆菌培养阴性的上清中,抗原的检出率能达到27.11%。定量分析后结果显示,在培养的这段时间内结核分枝杆菌特异性抗原38KD、ESAT6、CFP10的分泌量主要集中在0.75ng/ml～40ng/ml之间。结核分枝杆菌特异性抗原化学发光检测技术与商业化抗体检测试剂盒共同检测应用,抗原与抗体检测有一定的互补性。综上所述,本研究建立的结核分枝杆菌抗原化学发光定量检测方法,可用于结核病的早期辅助诊断。抗原检测能区分结核患者的既往感染与感染,同时可用于结核病患者治疗的疗效评价,具有一定的临床应用价值。
刘冬光[5]2010年在《牛分枝杆菌新型融合抗原的制备及在牛结核抗体检测中的应用》文中认为牛结核病(Bovine Tuberculosis, bTB)是一种严重危害养牛业的、慢性消耗性人兽共患病,主要由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis, M. bovis)感染所致。同时,牛分枝杆菌是人结核病的重要致病因子之一,野生动物是牛结核分枝杆菌重要的储存宿主。目前国内外控制家畜和野生动物结核病普遍采用“检疫-扑杀”的措施,因此,准确及时的诊断结核病对有效控制该病、保障动物和人类健康显得极为重要。目前法定的牛结核检疫方法是结核菌素皮内变态反应(Tuberculin skin test, TST),由于TST具有劳动强度大、操作复杂、费时、与卡介苗和非结核分枝杆菌等具有交叉反应等缺陷,牛结核病检测需要探索更加灵敏快速的检测方法。发达国家的实践也证实,控制或根除牛结核病非常有必要依靠实验室检测方法。国际兽疫局(OIE)也推荐使用皮试以外的方法,如IFN-y体外释放法、抗体检测法等。这些方法的关键之一就是选择灵敏特异的刺激抗原或诊断抗原。牛分枝杆菌感染机体过程中分泌多种抗原,使用单个抗原检测其抗体水平或刺激IFN-y体外释放时灵敏度较低。研究证明,“鸡尾酒”诊断方法能提高诊断的敏感性,但使用多种蛋白抗原存在生产费时费力,使用时配比不均,难于进行标准化生产等问题。鉴于以上原因,本研究对叁种RDl区缺失基因Rv3872、CFP10和ESAT6进行了融合表达Rv3872-CFP10-ESAT6 (RCE)叁蛋白,该蛋白可以区分卡介苗与毒力型结核分枝杆菌与牛分枝杆菌,并将Rv3872基因插入70-83-CE蛋白基因的前面,融合表达了Rv3872-MPB70-MPB83-CFP10-ESAT6 (R5)五蛋白,旨在为牛结核病临床诊断提供更加敏感、特异的诊断抗原。同时,建立了RCE间接ELISA方法,制备了RCE-胶体金试纸条并进行了初步应用。本研究的主要内容如下：1.两种融合蛋白表达载体的构建、抗原的表达纯化克隆了牛结核分枝杆菌RD1区基因Rv3872,构建了原核表达载体pET-28a-RCE和pET-28a-Rv3872-70-83-CE,诱导表达融合蛋白,并用亲和层析法进行纯化,得到了纯度较高的RCE蛋白,但R5蛋白在纯化时遇到困难,无法去除大部分杂带,这可能与串联基因过多有关2.两种融合蛋白特性分析ELISA和Western blot分析显示：两种融合蛋白均能与牛结核分枝杆菌阳性血清发生特异性反应,而与牛副结核病、牛布氏杆菌病、牛巴贝斯病和牛传染性鼻气管炎病阳性血清不反应。热稳定性试验证明两种融合蛋白热稳定性相似,在超过60℃温度处理一小时后,活性迅速降低。两种融合蛋白初步应用于ELISA,分别与本实验室克隆表达的CE蛋白和70-83-CE比较,结果显示,融合蛋白RCE比CE蛋白有更高的敏感性,而R5蛋白则可能由于串联的基因过多,各蛋白结构域互相覆盖部分抗原位点,导致敏感性远低于四联蛋白。说明RCE蛋白作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。3.RCE蛋白间接ELISA方法的建立和胶体金试纸条的制备通过方阵滴定,确定RCE-ELISA最佳工作条件：抗原的最佳包被浓度为15.625ng/mL,封闭液为5%的脱脂奶粉。一抗1：100倍(体积比)稀释,酶标二抗1：10000倍(体积比)稀释,滴加底物液反应10分钟后0.25%HF终止显色。RCE-胶体金试纸条最佳制备条件：抗原标记胶体金的最佳pH值为8.0,每毫升胶体金溶液中抗原最适标记量为224μg。检测线最佳抗原包被浓度为1.4mg/mL,质控线最佳IgG包被浓度为3.0mg/mL。交叉试验证明试纸条不与牛的其它非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性。检测同一份阳性牛血清进行比较实验,结果RCE-胶体金试纸条的敏感性比进口试纸条高4倍,证明其敏感性显着高于进口试纸条。4.RCE蛋白间接ELISA和胶体金试纸条在临床牛结核检测中的应用使用RCE-间接ELISA方法检测323份临床牛血清样本,其中TST阳性和阴性样本各为119和204份。ELISA和TST总符合率达到79.57%。RCE较CE蛋白的TST阳性符合率提高了18.49%；RCE-间接ELISA较CE-间接ELISA多检出阴性样本26份,比CE蛋白的TST阴性符合率提高了12.74%；说明RCE-间接ELISA较CE-间接ELISA具有更高的灵敏度与特异性。用RCE-胶体金试纸条检测301份牛血清,与进口试纸条比较,阳性符合率达到97.78%(88／89),阴性符合率达到95.91%(211／220),总符合率为96.45%(299／310)。说明本研究中的RCE-胶体金试纸条与国际上同类产品具有相似的灵敏度和特异性。检测了468份鹿血清,RCE蛋白比CE蛋白多检出阳性样本6份,阳性率提高了1.28%。RCE胶体金试纸条检测100份鹿血清,其中包括RCE-ELISA检出阳性9份,91份为抗体阴性。RCE-胶体金试纸条共检出阳性样本5份,阳性率5%,试纸条敏感性略低于ELISA (9%)5.RCE蛋白间接ELISA方法和胶体金试纸条在人结核病检测中的应用使用RCE-ELISA方法,检测32份结核病人血清,RCE-ELISA和CE-ELISA均检出阳性样本为25份,阳性符合率均为78.13%(25／32)。检测22份IFN-γ阳性人血清,RCE-ELISA和CE-ELISA均检出阳性样本为18份,阳性率81.82%(18／22)。从结果中可以看出,RCE-ELISA在人结核分枝感染中具有重要的应用价值。
陈全[6]2003年在《结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因原核表达载体的构建及重组CFP10-ESAT6融合蛋白的初步应用》文中研究说明本研究通过体外扩增MTB esat6、lhp及lhp-esat6融合基因，构建原核表达载体并在E.coli中表达，然后鉴定、分离及纯化重组蛋白。用动物试验和临床病例评价rCFP10-ESAT6融合蛋白在MTB感染免疫学诊断中的价值。第一部分 结核分枝杆菌esat6基因原核表达载体的构建及表达目的：构建MTB esat6基因原核表达质粒，在E.coli中表达并用亲合层析法纯化rESAT6蛋白。方法：以一对分别带有HindⅢ和BamHI酶切位点的引物，以MTB基因组为模板，用PCR法扩增MTB esat6基因，并将其克隆入pQE30质粒。测序正确后，再亚克隆入pET32a(+)质粒，构建pQE30-ESAT6和pET32a(+)-ESAT6重组体。用重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌，在IPTG诱导下进行表达。表达产物经SDS-PAGE鉴定，再经Ni-NTA柱纯化，并用活动性结核患者血清以Western-blot法鉴定其抗原性。结果：成功构建pQE30-ESAT6和pET32a(+)-ESAT6重组质粒，但pQE30-ESAT6在DH5α菌中未表达目的蛋白，而pET32a(+)-ESAT6在BL21（DE3）菌中高效表达了分子量为32kDa左右的rESAT6蛋白。IPTG诱导4h重组蛋白表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在
张书环[7]2007年在《牛结核病胶体金免疫层析方法的建立与初步运用》文中研究表明牛结核病(Bovine Tuberculosis，bTB)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的一种人兽共患传染病。被国际动物卫生组织(Office International DesEpizooties OIE)定为B类动物传染病，我国将其列为二类动物疫病。国内外的人结核病原学调查均发现，牛分枝杆菌是人结核的重要病因之一。世界卫生组织专家委员会第七次会议报告指出：除非消灭牛结核，否则人类结核病的控制是不会成功的。由于目前为止尚未发现有效药物与疫苗用于牛结核病的防治，一些国家普遍采用的是“检疫-捕杀”政策，即检疫出的阳性牛一律捕杀来实现控制牛结核病。因此，准确而及时的诊断方法对于该病的防治显得尤为重要。OIE唯一推荐的方法是牛型结核菌素皮内变态反应(Tuberculin skin test，TST)，结核菌素又称为纯化蛋白衍生物(purified protein derivatives，PPD)，是结核分枝杆菌在液体培养基中生长时产生的代谢物质，含有多种抗原成分，用于检测结核病时敏感性较高。但由于结核菌素可能包含有与其它分枝杆菌相同的非特异性抗原组份，检测时容易出现假阳性；结核菌素皮内变态反应对感染后期的开放性结核及全身性结核不敏感。因此，研究更加敏感特异的结核病新型诊断抗原和诊断方法，是控制牛结核病当务之急。牛分枝杆菌是细胞内寄生菌，MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6是M．bovis感染机体后分泌的主要抗原，诱导机体产生相应抗体。当用单个抗原检测其抗体水平反映牛结核感染状况时，灵敏度较低。经过大量研究证实“鸡尾酒”试验比任何单一抗原都要强，而且随着抗原数量的增多而增强。但“鸡尾酒”诊断方法中多种蛋白抗原生产费时费力，使用时配比不均，难于进行标准化生产等问题也已凸显出来，鉴于以上原因，本研究之一是对四种牛分枝杆菌抗原蛋白(MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6)进行了融合表达，旨在为牛结核病临床诊断提供一种敏感、特异的诊断抗原。胶体金免疫层析技术(Gold-Immunochromatographic Assay GICA)是近20年发展起来的一项免疫学检测技术。该技术不仅特异性强、敏感性高，而且不需昂贵仪器设备，操作简单快速。MPB83和MPB70已被证明是牛分枝杆菌主要的特异性分泌抗原。MPB70和MPB83蛋白的氨基酸序列具有63％的同源性，单克隆抗体验证了二者具有某些共同抗原决定簇。本研究利用牛分枝杆菌的两个同源蛋白质MPB70和MPB83，建立了一种双抗原夹心胶体金免疫层析法。旨在为牛结核病的临床诊断提供一种敏感、特异、快速、实用的新型诊断方法。主要研究内容包括：1．牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表达及相关特性分析克隆了牛分枝杆菌特异性抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的编码基因，构建原核表达载体，诱导表达蛋白，提纯融合蛋白质，并对其特性及其在牛结核病血清学诊断中的价值进行了初步评估。经ELISA验证该融合蛋白能分别与抗原蛋白MPB70、MPB83和CE(cfp10-esat6)的多抗反应，说明该融合蛋白具有四个抗原蛋白的免疫学活性。Western blot分析显示：该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应，而与牛副结核病、牛布氏杆菌病、牛巴贝斯病和牛传染性鼻气管炎病阳性血清不反应。热稳定性试验证明该融合蛋白具有与单个蛋白相同的热稳定性。结果显示，融合蛋白具有单个蛋白的免疫原性和稳定性，作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。2．牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立利用胶体金免疫层析技术原理，用原核诱导表达的牛分枝杆菌抗原蛋白MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原，制备牛结核抗体检测试纸条。结果粒径为40nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高；胶体金最佳标记pH值为6.0；MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5μg；MPB70抗原的最适包被浓度为3.0mg／mL；抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5mg／mL；交叉试验证明试纸条不与牛的其它非相关疾病的阳性血清反应，具有较高的特异性。比较实验证明其敏感性显着高于进口试纸条。3．牛结核病抗体胶体金快速检测技术的临床应用应用牛结核病抗体胶体金快速检测方法制备的胶体金试纸条进行临床样品检测，并与牛结核分枝杆菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较。本试纸条与牛分枝杆菌分离培养的符合率为85％，与TST的符合率为79.73％，与韩国试纸条的符合率为98.75％。快速检测牛结核抗体的免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点，适用于对牛结核病进行普查和检疫，也可作为TST的辅助诊断方法，在牛结核病根除计划中具有良好的应用前景。
徐贤坤[8]2009年在《水牛γ-干扰素单克隆抗体制备及水牛结核病夹心ELISA检测方法的初步建立》文中进行了进一步梳理牛结核病(tuberculosis,TB)是由牛结核分枝杆菌引起的慢性消耗性疾病,呈世界性分布。牛结核病的诊断方法主要有病原鉴定和皮内变态反应。细菌学检查需要5～8周时间,检出率低,且常有假阴性结果出现而不适合于流行病学调查和日常监测;结核菌素(PPD)皮内变态反应(TST)是国际贸易指定试验,该法技术简单,价格低廉,但其非特异性强,不是理想的牛结核病诊断方法;而且该检测方法只是针对牛属结核病检测设定,不适用于水牛属、羊等家畜及其他的野生动物结核病诊断。抗原特异性γ-干扰素试验是一种新型体外T细胞免疫检测试验,由于新的结核杆菌特异性抗原CFP10,ESAT6等的发现,提高了检测的敏感性和特异性,其应用于牛结核病的诊断受到广大研究者的关注。然而,目前该法的研究对象主要集中在牛属动物,而未见水牛属结核病检测方法的报道。针对近年来我国南方水牛规模不断扩大,养殖密度不断增加,水牛结核病感染率和发病率急剧攀升却无适合的方法开展检疫的现状,本研究拟利用抗原特异性γ-干扰素原理,建立一种适用于水牛结核病检测的方法,为水牛结核病诊断提供一种新的手段,为检疫和控制水牛结核病提供技术支持。主要的研究工作和成果如下:1、提取经刀豆素(ConA)诱导培养的水牛外周血淋巴细胞培养物总RNA,通过RT-PCR扩增出水牛IFN-γ(WBIFN-γ)前体的eDNA序列,然后将其定向克隆入PMD18-T质粒中,构建重组质粒PMD18-T-WBIFN-γ,并进行测序。序列分析结果表明,克隆获得的IFN-γ基因全长为544个碱基,水牛IFN-γ基因开放阅读框(ORF)为501个碱基,编码166个氨基酸,基因登录号为EF567075。与GenBank上已发表的水牛、牛的IFN-γ基因进行同源性比较,其核苷酸同源性均高于97%,推导氨基酸同源性高于96%。通过亚克隆从重组质粒PMD18-T-WBIFN-γ中扩增出WBIFN-γ的成熟肽段序列,并将其定向插入原核表达载体pGEX-6P-1和PET-32a,经DNA测序确认后,分别转化至BL21(DE3)重组菌,经IPTG诱导表达后,pGEX-WBIFN-γ/BL21与PET-WBIFN-γ/BL21重组菌各自表达出相对分子量分别为43Ku和37.4Ku左右的融合蛋白rGST-WBIFN-γ和rHIS-WBIFN-γ,融合蛋白的相对表达量最高可分别达到菌体总蛋白的约30%和45%,并分别用GST FF蛋白纯化柱和HIS FF蛋白纯化柱对融合蛋白rGST-WBIFN-γ和rHIS-WBIFN-γ进行纯化。将重组菌pGEX-WBIFN-γ/BL21与PET-WBIFN-γ/BL21及其纯化蛋白进行Western-blotting和ELISA试验,检测结果表明两种重组蛋白均能与牛IFN-γ单抗发生特异性反应,均具有良好的免疫活性。2、将pGEX-WBIFN-γ/BL21重组菌经诱导表达后取菌体进行SDS-PAGE电泳,切取rGST-WBIFN-γ目的条带及可溶性纯化蛋白分别免疫Balb/c小鼠,均能使免疫小鼠产生高效价的多克隆抗体。以可溶性重组蛋白rGST-WBIFN-γ和rHIS-WBIFN-γ作为双重筛选抗原建立间接ELISA方法,应用淋巴细胞杂交瘤技术,选取血清效价高的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经过3轮亚克隆筛选出2株能稳定分泌抗rWBIFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1E4,4A11;免疫球蛋白亚类鉴定其重链均为IgG1型,轻链为κ链,间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清效价均为1:3200,腹水效价均为1:819200;Western-blotting和Dot-ELISA分析显示,2株单抗均能特异性结合rGST-WBIFN-γ和rHIS-WBIFN-γ,而不与BL21(DE3)菌体裂解上清及其他重组蛋白反应,表明2株单抗均为针对水牛IFN-γ的特异性单抗。3、以罗氏培养法培养牛结核分枝杆菌标准株AN5并提取DNA模板,采用重组PCR方法从牛结核分枝杆菌AN5基因组中扩增CFP10-Linker-ESAT6融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体PET-32a,构建原核表达质粒PET-CFP10/ESAT6。重组子经酶切及测序鉴定后转化BL21(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳鉴定,其在相对分子量为42Ku表达带有6×HIS蛋白标签的rHIS-CFP10/ESAT6融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的40%,并用HIS FF蛋白纯化柱纯化该蛋白。Western blotting分析显示:该融合蛋白能与牛结核阳性血清发生特异性反应。将重组的该融合蛋白用于刺激单次皮内变态反应阳性牛全血,可以产生高水平的IFN-γ。用Bovigam~(TM)牛型结核ELISA试剂盒检测结果与皮内变态反应反应对比显示,PPD抗原敏感性为85.71%,特异性为69.23%,符合率为75%:rHIS-CFP10/ESAT6抗原的敏感性为77.78%,特异性为72.27%,符合率为75%。研究结果显示,应用牛和禽PPD比较反应检测牛结核阳性牛IFN-γ释放反应的准确度较低,混合感染牛可能被误判为结核阴性牛,而基于rHIS-CFP10/ESAT6的IFN-γ释放反应不受环境分枝杆菌的影响,检测具有良好的特异性。4、利用筛选得到的两株抗水牛γ-干扰素的单克隆抗体,对其中的一株纯化单抗进行HRP标记作为检测抗体,另一株纯化单抗作为捕获抗体,建立检测水牛结核病的γ-干扰素双单克隆抗体夹心ELISA。通过对封闭液、稀释液等条件进行优化,经过方阵滴定实验确定捕获抗体的最佳浓度为625ng/mL,检测抗体的工作效价为1:100,确定样本经rHIS-CFP10/ESAT6抗原刺激血浆OD值减去阴性OD值大于0.3判定为阳性,检测灵敏度为25ng/mL,批内变异系数为0.52%～6.86%,批间变异系数为5.6%～7.07%,稳定性良好。采集60头单次皮内变态反应水牛肝素抗凝全血,利用牛结核分枝杆菌特异性抗原rHIS-CFP10/ESAT6体外刺激水牛外周血淋巴细胞释放IFN-｜。用所建立的夹心ELISA检测所有样本,与皮内变态反应试验比较结果显示,自制夹心ELISA方法检测水牛结核病的敏感性为81.81%,特异性为71.05%,符合率为75%。该法的初步建立可作为皮内变态反应的辅助方法应用于水牛结核病的检测,为将来摸清广西水牛结核病流行情况,制定相应的防控措施提供技术支持。
牟巍[9]2009年在《牛结核分枝杆菌cfp10-esat6融合基因的表达及其表达产物在诊断中的初步应用》文中研究指明牛结核病是一种由牛结核分枝杆菌引起的人畜共患传染病。牛结核病传统诊断方法为牛结核菌素(PPD)皮内变态反应试验,但PPD存在与其它分支杆菌的抗原交叉反应影响了该方法的特异性。编码CFP10、ESAT6两蛋白的基因仅存在于牛结核分枝杆菌中,禽结核、副结核等分枝杆菌则无这两种基因,两蛋白为良好的牛结核病诊断候选抗原。本研究以牛结核分支杆菌C68001基因组DNA为模板,采用基因拼接(Gene SOEing)技术,经重迭PCR扩增获得cfp10-esat6融合基因,并克隆到pET32a(+)表达载体,构建了重组质粒pET32a(+)-cfp10-esat6,将其转化入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,得到43KD的可溶性目的蛋白,在最佳表达条件下,表达量可达总蛋白的42%。Western blot试验表明,重组蛋白CFP10-ESAT6可被牛结核阳性血清识别。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化,其纯度可达90%。用纯化的重组蛋白对经牛结核分枝杆菌、禽结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌致敏的豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)试验,结果表明,1μg重组蛋白可以诱导牛结核分枝杆菌致敏的豚鼠产生与10IUPPD相当的DTH(红肿平均直径为1.34cm)。而重组蛋白诱导禽结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌致敏豚鼠的DTH较弱(红肿平均直径为0.30cm),能特异地区分牛结核致敏分枝杆菌与禽结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌致敏的豚鼠。用纯化的重组蛋白和PPD同时对40头牛进行临床检测,结果表明,16μg重组蛋白可以诱导牛结核感染牛产生强烈的DTH反应,与牛PPD皮试结果符合率达到85%。分别以重组蛋白和PPD作为刺激原进行牛结核病γ干扰素ELISA检测试验,2μg融合蛋白可以刺激全血产生高水平的γ干扰素,与PPD作为刺激原的检测结果相比符合率为90%。结果表明,重组蛋白作为临床牛皮试反应的检测试剂以及IFN-γELISA反应的刺激原均具有很高的敏感性,该重组蛋白作为牛结核诊断试剂具有良好的应用前景。
郭芳芳[10]2011年在《结核杆菌培养滤液蛋白10参照品的制备及其检测方法的初步建立》文中研究说明研究背景结核病是经呼吸道传播的慢性传染病,主要发生在肺部,是单一致病菌感染导致死亡率最高的世界性重要传染病[1]。回顾性调查结果表明,我国结核病的误诊率可达24%,提高结核病的实验诊断率已刻不容缓。因此,利用简单、快速、准确的实验室检查尽早对结核病做出诊断对控制结核病疫情至关重要。目前结核病诊断的金标准是细菌学检查,但是涂片和培养的阳性检出率较低,而且细菌培养也较费时,无法对结核病做出及时的诊断[2]。由于机体受到结核菌感染后,体内首先出现的是结核抗原,因此检测结核抗原有重要的早期诊断价值,并且结核抗原的检测可以作为结核杆菌存在的直接证据,且可以避免结核病患者由于免疫应答低下导致的体液免疫检测或细胞免疫检测的“假阴性”,因此与检测结核分枝杆菌抗体相比,检测特异性抗原更有可能发展成为结核病早期、快速、特异的新型诊断方法。最早的结核杆菌抗原是将结核分枝杆菌培养在含有甘油的液体培养基中,经过滤除菌、浓缩制备而成,称为旧结核菌素。1932年以来,应用蛋白纯化手段进一步纯化旧结核菌素,所得产物即为结核菌素蛋白衍生物(purified protein derivation of tuberculin, PPD)。PPD主要用于结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test),由于其抗原成分复杂,大多成分为非结核分枝杆菌和卡介苗(BCG)所共有,因此特异性低,不能区分感染者和卡介苗接种者,同时对感染后期的开放性结核和全身性结核不敏感。培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10, CFP10)是近年来从结核分枝杆菌培养滤液中发现的分子量约为10KDa的高度特异性抗原,为人型结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌所特有,卡介苗(BCG)及非致病分枝杆菌缺乏,具有良好的免疫原性,可作为诊断结核病的一个特异性候选抗原,但通常结核病患者血清或体液(痰、胸腔积液、脑脊液、关节积液等)中CFP10含量非常低,用ELISA、胶体金免疫层析等方法检测,难以达到理想的效果。时间分辨荧光免疫分析技术(time-resolve fluoroimmunoassay, TRFIA)是自80年代以来新发展起来的一种新型标记分析技术,与其它免疫标记分析技术相比,有其独特的优点。它克服了放射性免疫分析法(Radioimmunoassay, RIA)中放射性同位素带来的污染问题；克服了酶免疫分析法(Enzyme immunoassay,EIA)中酶不稳定的缺点；而且,由于镧系元素独特的荧光特点和TRFIA检测中采用的波长分辨和时间延迟技术,能够很好的消除背景荧光的干扰,并可通过解离增强技术,使荧光信号放大百万倍,使其灵敏度比普通荧光法(Fluoroimmunoassay, FIA)高出几个数量级,具有灵敏度高(10-18 mol/孔)操作简便、易自动化、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰、标记物制备简便且稳定、无放射性污染、多标记等特点,目前已经成为了一种极具临床应用潜力的超微量分析技术。我们通过基因工程技术制备了CFP10的叁种重组蛋白,CFP10及链亲和素标记的CFP10/SA,将重组抗原进行纯化、复性、鉴定后,应用时间分辨荧光免疫分析技术,以双抗体夹心法建立反应模式并优化条件。然后分别对CFP10、CFP10/SA在分析灵敏度、稳定性方面进行比较,筛选出最优的靶标蛋白做为检测CFP10的参考标准品,并初步建立了时间分辨荧光免疫分析检测CFP10的方法。目的制备CFP10的叁种重组蛋白,CFP10及链亲和素标记的CFP10/SA,从中筛选出合适的靶标蛋白做为检测CFP10的参考标准品,并初步建立时间分辨荧光免疫分析检测CFP10的方法。方法1.重组质粒的构建根据CFP10的基因序列及所选载体的多克隆位点设计引物,以结核分支杆菌标准株H37RV全基因组为模板,加入PCR相关试剂,扩增CFP10片段,并根据设计的酶切位点与pET21a-SA载体及pET24b、pET24b-SA载体进行酶切后连接,转化DH5α感受态细胞,从转化抗性平板上挑取若干单克隆菌落,进行菌落PCR鉴定及双酶切鉴定,选择鉴定成功者送公司双向测序。2.重组蛋白的表达,纯化将测序正确的质粒转化大肠杆菌Rosetta,分别挑取3个单克隆菌落接种于3mlLB标准培养基中,培养至OD600=0.4-0.6时,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,分别选用不同温度和不同的诱导时间进行培养,比较不同的实验条件对重组蛋白表达量的影响,对表达条件进行优化。根据最优培养诱导条件,大量扩菌表达,收集菌体,加入裂解液,冰浴超声裂解细菌,通过SDS-PAGE电泳分析蛋白的表达形式,并对包涵体表达的蛋白以本室发明的五步洗涤法予以洗涤。将洗涤后包涵体经8M尿素充分溶解后,经镍金属螯合层析柱(Ni-NTA)分离纯化,对于可溶性表达的重组蛋白则收集破菌后的上清经过滤后直接经亲和层析柱纯化。3.重组蛋白的复性及Western blotting鉴定将纯化后的变性蛋白浓度调整至0.2 mg/mL,在大于50倍体积的透析液(50mmol/L Tris-HCl,5M尿素,0.5M L-Arg,0.1% PEG8000,0.5M EDTA)中,4℃尿素梯度(5M-3M-2M-1M-0M Urea)透析复性,每4h换液一次至0M尿素,最后用50 mmol/L Tris-Hcl (PH8.0)缓慢透析12-24h,离心收集上清。并在透析过程中观察透析袋中蛋白的溶解度,是否浑浊或有沉淀形成,复性后蛋白经SDS-PAGE电泳观察复性效果。重组蛋白经SDS-PAGE电泳分离后,利用湿电转法将蛋白转移至PVDF膜上。0.2%的丽春红染色,观察转移效果,满意后,用封闭液(5%脱脂奶粉,PBST配制)37℃孵育2h,洗膜,加入封闭液稀释的小鼠CFP10单克隆抗体,37℃孵育2h,洗膜,加入PBST稀释的二抗HRP标记的山羊抗小鼠IgG,37℃孵育1h,充分洗膜后,加入DAB试剂显色,显色合适时,去离子水终止。4.时间分辨荧光免疫分析法检测CFP10参照品的筛选鉴定应用时间分辨荧光免疫分析技术,以双抗体夹心法对建立反应模式并对包被抗体和标记抗体的浓度进行优化。然后分别对CFP10、SA/CFP10在分析灵敏度、稳定性等方面进行比较,选择合适的靶标蛋白做为检测CFP10的参考标准品,并对参考标准品在线性、精密度及特异性等方面进行分析评价。结果1.重组质粒的构建构建的叁个重组质粒经DNA序列测定,测序结果与GeneBank中收录的SA及CFP10序列进行比对,均完全一致且无读码错误。2.重组蛋白的表达、纯化将测序正确的质粒转化大肠杆菌Rosetta,进行诱导表达,收集菌体经超声波破菌,SDS-PAGE电泳结果显示SA-CFP10及CFP10-SA分子量均在30KDa左右,与理论值基本相符,表达量分别约占菌体总蛋白25%和30%左右。CFP10分子量在10KDa左右与理论值基本相符,其表达量约占菌体总蛋白35%左右。融合蛋白SA/CFP10主要以包涵体形式存在于破菌后沉淀,而CFP10重组蛋白则以可溶形式存在于破菌后上清中。融合蛋白SA/CFP10洗涤包涵体后,可溶性CFP10重组蛋白过滤后,均经Ni-NTA, His-tag纯化,SDS-PAGE电泳结果显示,叁种重组蛋白的纯化效果均较好,纯度均可达90%以上。3.重组蛋白的复性及Western blotting鉴定将纯化后的融合蛋白CFP10/SA置于透析袋内,于透析液中尿素梯度4℃透析复性,SDS-PAGE电泳结果可看到非还原条带上有聚体出现(链亲和素SA本身可形成四聚体)。将可溶性表达的CFP10于2M轻微变性后,以等同于CFP10/SA的复性条件复性。经Western blotting鉴定,叁种重组蛋白均可与进口CFP10单克隆抗体发生特异性反应。4.时间分辨荧光免疫分析法检测CFP10参照品的筛选鉴定我们建立了时间分辨荧光双抗体夹心法,并对包被抗体和标记抗体进行浓度优化,以正交试验确定最优条件为：包被抗体浓度为3μg/mL,标记抗体浓度为0.8μg/mL。对自制的CFP10-SA. SA-CFP10及CFP10在分析灵敏度、稳定性方面进行了比较,证明CFP10-SA为最优,其线性范围为0-80ng/ml,最低检测浓度可达0.02ng/ml,分别在37℃放置7天,14天,21天,28天,其最大降解率低于8%,为最优。通过对其精密度分析,批内的CV<6%,批间的CV<5%,精密度良好。特异性实验结果证明,CFP10-SA与SA-IL15、SA-GM-CSF、ESAT6、SA-ESAT6、ESAT6-SA均无交叉反应,特异性良好。绘制双对数函数TRFIA标准曲线,其R2=0.9997,相关性良好,而且具有较好的重复性。该参考标准品的成功筛选,及双抗体夹心法时间分辨荧光免疫分析检测CFP10方法的初步建立,为进一步研究结核分枝杆菌培养滤液蛋白10时间分辨荧光分析检测试剂盒及其临床应用打下了基础。结论1.成功制备了CFP10-SA、SA-CFP10及CFP10重组蛋白2.初步建立了时间分辨荧光免疫分析法检测CFP10的方法,并筛选出了最优参照品CFP10-SA
参考文献：
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