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枯草芽孢杆菌S1-4的ARTP诱变、发酵条件优化及BsuKER-68基因的克隆与表达

2020-12-02阅读(490)

枯草芽孢杆菌S1-4的ARTP诱变、发酵条件优化及BsuKER-68基因的克隆与表达

论文摘要

碱性蛋白酶广泛应用于洗涤剂、食品、制药、皮革、诊断、废物管理和白银回收等行业,具有重要的商业价值。本文重点研究了碱性蛋白酶生产菌种的诱变筛选、微生物碱性蛋白酶的生产和发酵优化及碱性蛋白酶基因的克隆与表达。本研究利用常压室温等离子体诱变技术对B.subtilis S1-4菌株进行诱变,以He作为放电气体,气体流量为10 L/min,射频功率为120 W,诱变时间为20 s、40 s、60 s、80 s。通过酪蛋白平板初筛,挑出水解圈较大的14株突变株,再通过实验室摇瓶复筛得到一株高产碱性蛋白酶菌株。经形态观察和16S rDNA序列的比较分析,将其命名为B.subtilis S1-4-2-21,其碱性蛋白酶活力最高可达25.4 U/mL,相比原始菌株酶活力提高了约2倍,羽毛降解率提高了4.33%。将酶活力最高的突变株B.subtilis S1-4-2-21进行全基因组重测序,与野生菌株的参考基因组进行比较,SNP突变主要发生在A-C碱基和A-G碱基之间,非同义突变占14%,大部分的SNP突变发生在基因间序列。InDel突变主要发生在Shift,CDS区域序列,该区域可以引起移码突变。结构性变异总共有98个,其中染色体内部迁移有2个,染色体间的迁移有96个。为研究不同培养基组分和发酵条件对该菌株的产酶影响,本研究在单因素实验的基础上选取了麸皮含量、蛋白胨含量、初始pH值三个因素为自变量,将产生的碱性蛋白酶酶活力作为因变量,进行了三因素三水平的响应面试验。优化后的发酵培养基组成为:麸皮浓度为49.46 g/L,蛋白胨浓度为25 g/L,初始pH为7,接种量为3%,发酵温度为40℃,发酵时间为60 h,发酵优化后的碱性蛋白酶酶活力最大可达128.98 U/mL,较优化前提高了约5倍。为研究枯草芽孢杆菌S1-4降解羽毛的机理,本研究克隆了枯草芽孢杆菌S1-4的角蛋白酶基因BsuKER-68,并获得全长基因序列2421 bp,该基因含有一个2271 bp的开放阅读框,编码757个氨基酸。利用DNAMAN、MEGA、TMPRED、SWISS-MODEL、SOPMA等生物信息学工具对其进化树、跨膜结构分析、三级结构预测、理化性质及其二级结构等进行分析,发现其与NCBI中角蛋白酶基因的相似性为99%;相对分子质量为82.7 kD,等电点为6.06;该基因蛋白为亲水性蛋白;在1-17位氨基酸具有明显的跨膜结构;系统进化树分析结果与菌株信息相一致。用同源重组的方法得到重组质粒pSU03-BsuKER-68,并转入枯草芽孢杆菌WB600。由于目的基因在枯草芽孢杆菌WB600中的产物为胞外酶,其碱性蛋白酶可在发酵液中产生,酶活力最高可达10.6 U/mL。总之,本研究采用ARTP诱变技术诱变筛选得到一株碱性蛋白酶酶活力较高的枯草芽孢杆菌。通过基因组重测序分析得到SNP突变、InDel突变及SV突变区域。以B.subtilis S1-4为模板,成功克隆了BsuKER-68基因,并在枯草芽孢杆菌WB600中得到表达。本研究工作的开展为进一步筛选高品质碱性蛋白酶生产菌株提供了信息,同时也为将来通过基因工程改造碱性蛋白酶及其工业应用奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 绪论
  •   1.1 引言
  •   1.2 碱性蛋白酶的结构和性质
  •     1.2.1 碱性蛋白酶的结构
  •     1.2.2 碱性蛋白酶的性质
  •   1.3 碱性蛋白酶的应用
  •     1.3.1 碱性蛋白酶在食品加工行业的应用
  •     1.3.2 皮革制作
  •     1.3.3 纺织工业
  •     1.3.4 洗涤剂、添加剂
  •     1.3.5 碱性蛋白酶的医学应用
  •     1.3.6 碱性蛋白酶在核酸分离中的研究应用
  •     1.3.7 细胞隔离和组织分离
  •     1.3.8 细胞培养
  •     1.3.9 废物处理
  •   1.4 碱性蛋白酶的生产方法
  •     1.4.1 微生物发酵法
  •     1.4.2 菌株克隆法
  •     1.4.3 碱性蛋白酶的发酵生产
  •   1.5 菌种诱变的研究现状
  •     1.5.1 微波诱变
  •     1.5.2 紫外诱变
  •     1.5.3 ARTP诱变
  •   1.6 国内外现状及前景
  •   1.7 研究目的及意义
  •   1.8 本课题的主要内容
  •   1.9 实验路线
  • 2 枯草芽孢杆菌S1-4的ARTP诱变及全基因组重测序
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验材料与仪器
  •     2.2.1 实验菌株
  •     2.2.2 主要仪器及试剂
  •     2.2.3 主要溶液
  •     2.2.4 培养基
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 生长曲线的测定
  •     2.3.2 碱性蛋白酶的酶活力测定
  •     2.3.3 DNA提取
  •     2.3.4 ARTP诱变
  •     2.3.5 高产菌株的初筛
  •     2.3.6 高产菌株的复筛
  •     2.3.7 羽毛降解实验
  •     2.3.8 DNA提取及检测
  •     2.3.9 文库构建及测序
  •     2.3.10 测序数据质控
  •     2.3.11 与参考基因组比对
  •   2.4 结果与分析
  •     2.4.1 枯草芽孢杆菌S1-4的生长曲线
  •     2.4.2 枯草芽孢杆菌S1-4的酶活力曲线
  •     2.4.3 枯草芽孢杆菌S1-4的鸡毛失重率曲线
  •     2.4.5 ARTP诱变的致死率曲线
  •     2.4.6 碱性蛋白酶酶活力高产菌株的初筛
  •     2.4.7 酶活力高产菌株的复筛结果
  •     2.4.8 羽毛降解率测定
  •     2.4.9 诱变菌株的生长曲线
  •     2.4.10 DNA样品检测和16S rDNA序列测定与分析
  •     2.4.11 测序数据产出及质控结果
  •     2.4.12 测序数据比对结果
  •     2.4.13 SNP及InDel结果分析
  •     2.4.14 SV检测及注释
  •     2.4.15 全基因组变异图谱
  •   2.5 讨论
  •   2.6 小结
  • 3 枯草芽孢杆菌的产酶优化
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验材料与仪器设备
  •     3.2.1 实验菌株
  •     3.2.2 设备和药品
  •     3.2.3 培养基
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 酶活力测定
  •     3.3.2 发酵条件优化
  •   3.4 结果与分析
  •     3.4.1 不同发酵时间对B.subtilis S1-4-2-21发酵产酶的影响
  •     3.4.2 不同碳源和氮源对发酵产酶的影响
  •     3.4.3 不同碳源初始浓度对发酵产酶的影响
  •     3.4.4 不同氮源初始浓度对发酵产酶的影响
  •     3.4.5 不同初始pH值对发酵产酶的影响
  •     3.4.6 不同接种量对发酵产酶的影响
  •     3.4.7 不同温度对发酵产酶的影响
  •     3.4.8 显著影响因素
  •     3.4.9 响应面优化
  •   3.5 讨论
  •   3.6 本章小结
  • 4 枯草芽孢杆菌角蛋白酶基因BsuKER-68的克隆及表达
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验材料与仪器设备
  •     4.2.1 实验菌株
  •     4.2.2 载体
  •     4.2.3 引物序列
  •     4.2.4 仪器设备和药品
  •     4.2.5 培养基及溶液
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 DNA的提取
  •     4.3.2 基因扩增体系及条件
  •     4.3.3 PCR产物的胶回收
  •     4.3.4 质粒提取
  •     4.3.5 酶切及纯化
  •     4.3.6 连接
  •     4.3.7 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
  •     4.3.8 大肠杆菌内质粒的小批量提取
  •     4.3.9 枯草芽孢杆菌转化
  •     4.3.10 酶活力测定
  •     4.3.11 序列分析
  •   4.4 结果与分析
  •     4.4.1 B.subtilis S-14菌株总DNA提取
  •     4.4.3 质粒的提取
  •     4.4.4 重组质粒转化枯草芽孢杆菌WB600
  •     4.4.5 BsuKER-68基因的重组子检测
  •     4.4.6 生长曲线的测定
  •     4.4.7 枯草芽孢杆菌PSU03-BsuKER-68酶活力曲线
  •     4.4.8 序列比对分析
  •     4.4.9 理化性质分析
  •     4.4.10 跨膜区域分析
  •     4.4.11 信号肽分析
  •     4.4.12 结构分析
  •     4.4.13 系统进化树分析
  •   4.5 讨论
  •   4.6 本章小结
  • 5 总结
  • 参考文献
  • 致谢
  • 在读期间发表或被接收的文章

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 郑海燕

    导师: 雍彬

    关键词: 羽毛降解,诱变,基因组重测序,碱性蛋白酶

    来源: 四川师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 四川师范大学

    分类号: Q78

    DOI: 10.27347/d.cnki.gssdu.2019.000020

    总页数: 86

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