基于组学技术的枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs对炭疽菌和褐腐菌的影响及应用研究

论文摘要

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种抑菌活性强、抑菌谱广、安全无毒害的生防细菌。由胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的荔枝炭疽病和褐腐菌（Monilinia fruticola）引起的桃褐腐病是造成荔枝和桃果实采后损失的重要原因。本论文以枯草芽孢杆菌CF-3作为目标菌,以荔枝炭疽菌和桃褐腐菌作为供试病原菌。通过转录组学和蛋白组学技术分析了枯草芽孢杆菌CF-3产生的挥发性有机物质（VOCs）对果蔬采后病原真菌炭疽菌和褐腐菌的抑制作用,从基因和蛋白水平揭示了CF-3 VOCs抑制两种采后病原真菌的分子机制;并通过对果实生理生化指标的分析研究了CF-3 VOCs联合热处理对荔枝和桃果实采后病害的防控作用,为生防菌的精准开发利用奠定了理论基础。主要结论如下:1)通过高通量测序的方法,分析了CF-3的VOCs及其主效成分2,4-二叔丁基苯酚处理对炭疽菌的影响。从转录组数据可看出,LC vs LK组（CF-3 24 h发酵液处理炭疽菌vs空白对照处理炭疽菌）中有2320个差异表达基因,L24 vs LK组（2,4-二叔丁基苯酚vs空白对照）获得了2918个差异表达基因,其中有1030个共有的差异表达基因。这些差异表达基因充分参与了细胞的生物过程、分子功能和细胞组分;通过KEGG通路富集分析了差异基因参与的相关通路,主要富集在氨基酸的生物合成通路和碳代谢通路中,其中LC vs LK组主要富集在苯丙氨酸代谢通路及丙氨酸通路,L24 vs LK组主要富集在氨基糖和核苷酸糖代谢和脂肪酸代谢通路。2)通过TMT技术分析了CF-3的VOCs及其主效成分2,4-二叔丁基苯酚处理对炭疽菌的影响。从蛋白组数据可看出,LC vs LK组共鉴定出565个差异表达蛋白,L24 vs LK组共鉴定出831个差异表达蛋白。通过KEGG通路注释分析了差异蛋白质参与的相关代谢通路,发现处理对炭疽菌不同代谢途径产生了明显的影响,主要包括能量代谢、脂质代谢、次生代谢物的生物合成（LC vs LK）、氨基酸代谢（LC vs LK）和其他氨基酸的代谢等,对其他通路中的翻译、信号转导、运输和分解代谢等也产生明显的影响。故CF-3 VOCs和2,4-二叔丁基苯酚可能通过影响炭疽菌基本的物质代谢和能量代谢相关蛋白来抑制其生长。3)通过高通量测序的方法,分析了CF-3的VOCs处理对褐腐菌的影响。从转录组数据可看出,TK vs TC组（CF-3 24 h发酵液处理褐腐菌vs空白对照处理褐腐菌）获得了1602个差异表达基因。通过对差异表达基因进行分类和富集分析可知,其主要富集在抗生素的生物合成、淀粉和蔗糖代谢及氨基酸的生物合成等通路;碳水化合物的运输和新陈代谢、能量产生和转换为显著分类,故VOCs可能通过影响褐腐菌本身碳水化合物和能量代谢的相关途径来抑制其生长。4)通过TMT技术分析了CF-3的VOCs对褐腐菌的影响。从蛋白组数据可看出,TK vs TC组鉴定出1008个差异蛋白,这些差异表达蛋白充分参与了细胞的生物学过程、分子功能和细胞组分。对差异表达蛋白进行富集分析可知,其主要富集在次生代谢物的生物合成、碳代谢、翻译和抗生素的生物合成等通路。5)将CF-3 VOCs和热处理技术相结合,研究了联合处理对荔枝和桃果实上两种病原真菌的影响。结果表明,经过联合处理可显著降低荔枝和桃果实的腐烂指数,更好的保持果实失重率、可溶性固形物含量和桃果实的硬度、成熟度,保持水果的质量;过氧化物酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶这四种抗氧化相关酶的酶活均显著高于空白对照组和其他处理组,苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶这三种抗病相关酶的酶活均显著高于空白对照组和其他处理组;CF-3 VOCs联合热处理可以优势互补,更好的激活果实体内的抗氧化保护系统和抗病性酶系统,以防止植物细胞受到氧化伤害,同时更有效的抵御病原真菌的入侵。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第一章绪论

1.1 课题来源

1.2 果蔬采后真菌病害及控制的研究现状

1.2.1 化学防控

1.2.2 物理防控

1.2.3 生物防控

1.2.4 联合防控

1.3 枯草芽孢杆菌对果蔬采后病原真菌抑制作用研究现状

1.3.1 营养和空间位点的竞争

1.3.2 诱导植物系统抗性

1.3.3 分泌抗菌物质

1.4 组学技术在控制果蔬采后真菌病害研究中的应用

1.4.1 转录组学技术在控制果蔬采后真菌病害研究中的应用

1.4.2 蛋白组学技术在控制果蔬采后真菌病害研究中的应用

1.5 立题背景

1.6 论文的研究内容及技术路线

1.6.1 研究内容

1.6.2 技术路线

第二章枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs对炭疽菌抑制作用的转录组学研究

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 供试菌株

2.2.2 主要试剂

2.2.3 主要仪器设备

2.2.4 枯草芽孢杆菌CF-324 h发酵液的制备

2.2.5 炭疽菌培养与处理

2.2.6 RNA提取、定量和鉴定

2.2.7 转录组测序文库的构建

2.2.8 聚类和测序

2.2.9 数据分析

2.3 结果与分析

2.3.1 测序质量评估

2.3.2 转录组数据与参考基因组序列比对

2.3.3 差异表达基因分析

2.3.4 差异表达基因GO分类

2.3.5 差异表达基因COG分类

2.3.6 差异表达基因KEGG注释分类

2.3.7 差异表达基因KEGG通路富集分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs对炭疽菌抑制作用的蛋白组学研究

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.2.1 供试菌株

3.2.2 主要试剂

3.2.3 主要仪器设备

3.2.4 枯草芽孢杆菌CF-324 h发酵液的制备

3.2.5 炭疽菌的培养与处理

3.2.6 炭疽菌蛋白提取和定量

3.2.7 SDS-PAGE凝胶电泳

3.2.8 蛋白质酶解及肽段脱盐

3.2.9 TMT肽段标记与肽段分级

3.2.10 LC-MS/MS分析

3.2.11 数据库检索

3.2.12 生物信息学分析

3.3 结果与分析

3.3.1 SDS-PAGE鉴定蛋白提取质量

3.3.2 蛋白质鉴定及定量结果

3.3.3 差异表达蛋白分析

3.3.4 差异表达蛋白的GO富集分析

3.3.5 差异表达蛋白的KEGG通路富集分析

3.4 讨论

3.5 小结

第四章枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs对褐腐菌抑制作用的转录组学研究

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.2.1 供试菌株

4.2.2 主要试剂

4.2.3 主要仪器设备

4.2.4 枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs24h发酵液的制备

4.2.5 褐腐菌的培养与处理

4.2.6 RNA提取、定量和鉴定

4.2.7 转录组测序文库的构建

4.2.8 聚类和测序

4.2.9 数据分析

4.3 结果与分析

4.3.1 测序质量评估

4.3.2 转录本拼接

4.3.3 转录组数据与组装结果的比对

4.3.4 差异表达基因分析

4.3.5 差异表达基因GO分类

4.3.6 差异表达基因COG分类

4.3.7 差异表达基因KEGG注释分类

4.3.8 差异表达基因KEGG通路富集分析

4.4 讨论

4.5 小结

第五章枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs对褐腐菌抑制作用的蛋白组学研究

5.1 引言

5.2 材料和方法

5.2.1 供试菌株

5.2.2 主要试剂

5.2.3 主要仪器设备

5.2.4 枯草芽孢杆菌CF-324 h发酵液的制备

5.2.5 褐腐菌的培养与处理

5.2.6 褐腐菌蛋白提取和定量

5.2.7 SDS-PAGE凝胶电泳

5.2.8 蛋白质酶解及肽段脱盐

5.2.9 TMT肽段标记与肽段分级

5.2.10 LC-MS/MS分析

5.2.11 数据库检索

5.2.12 生物信息学分析

5.3 结果与分析

5.3.1 SDS-PAGE鉴定蛋白提取质量

5.3.2 蛋白质鉴定及定量结果

5.3.3 差异表达蛋白分析

5.3.4 差异表达蛋白的GO富集分析

5.3.5 差异表达蛋白的KEGG通路富集分析

5.4 讨论

5.5 小结

第六章枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs联合热处理对水果采后保鲜效果的研究

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 供试菌株与水果

6.2.2 主要试剂

6.2.3 主要仪器设备

6.2.4 致病菌孢子悬液的制备

6.2.5 枯草芽孢杆菌CF-324h发酵液的制备

6.2.6 果实样品接菌及处理

6.2.7 果实样品取样

6.2.8 腐烂指数的测定

6.2.9 失重率和可溶性固形物的测定

6.2.10 硬度和成熟度的测定

6.2.11 酶活指标测定

6.2.12 统计学分析

6.3 结果与讨论

6.3.1 VOCs联合热处理对接种炭疽菌的荔枝果实的影响

6.3.2 VOCs联合热处理对接种褐腐菌的桃果实的影响

6.4 小结

第七章总结与展望

7.1 总结

7.2 展望

参考文献

作者在攻读硕士学位期间公开发表的论文

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吴诗媛

导师: 高海燕

关键词: 枯草芽孢杆菌,桃褐腐菌,荔枝炭疽菌,组学技术,联合防控

来源: 上海大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 上海大学

基金: 上海市科委课题《鲜食水果微生物源绿色防腐与安全保鲜技术研发》,项目编号为No.18391901300,“十二五”国家科技支撑计划项目《微生物源生物拮抗菌剂的研发》,项目编号为 2015BAD16B02

分类号: TS201.3

DOI: 10.27300/d.cnki.gshau.2019.000433

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基于组学技术的枯草芽孢杆菌CF-3 VOCs对炭疽菌和褐腐菌的影响及应用研究

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